PriCells: 正常人表皮黑色素細胞的培養

實驗材料：

1. 臨床活檢獲取的正常人皮膚材料或新生兒yin莖包皮；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 黑素細胞培養液和培養基中各種添加劑的配制：包括以下種類：①胰島素。貯存液為5mg/ml，即將0.5g的胰島素溶于1ml 0.01mol/L的HCl液中，雙蒸水加至100ml，過濾除菌、分裝，-70℃下保存6個月后方可使用。使用時，在500ml培養基中加0.5ml胰島素貯存液，即終濃度為5μg/ml；②表皮生長因子。貯存液濃度為5μg/ml，其配制方法是，取0.1mg的表皮生長因子溶于20ml的無Ca2+和Mg2+的D-Hanks液中，以0.2μm孔徑的濾膜過濾除菌，按1ml分裝，-70℃下保存備用。使用時，在500ml培養液中加0.5ml表皮生長因子貯存液，即終濃度為5ng/ml；③十四煥酰法佛醋酸酯（TPA）。貯存液濃度為0.25mg/ml，配制時將10mg TPA溶于40ml的100%的酒精中，分裝后用Parafilm密封，于-20℃保存備用。使用時，在500ml培養基中加20μl的TPA貯存液，即終濃度為10ng/ml；④黑素細胞培養液：MCDB153培養基，使用時添加2mmol/L CaCl2，以4:1比例（V/V）添加Leibovtz L-15、2%胎牛血清、5μg/ml胰島素、5ng/ml表皮生長因子和10ng/mlTPA，并加入40μg/ml的牛垂體提取物。4℃下保存備用。

4. 其它培養用液：①皮膚材料保存液。主要用于不能即刻進行細胞分離的皮膚材料的保存。為無Ca2+和Mg2+的D-Hanks液，使用時添加100 IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素、100μg/ml慶大霉素和0.25μg/ml兩性霉素B，過濾除菌后備用；②表皮消化液。為0.25%的胰蛋白酶溶液。用2.5%的胰蛋白酶溶液0.5ml加4.5ml的無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液；③細胞分散液。主要用于細胞分離消化過程中防止細胞聚集形成團塊。用MCDB153培養基配制含1.25U/ml中性蛋白酶、0.1%（V/V）透明質酸酶和10%胎牛血清即成細胞分散液，另添加2mmol/L CaCl2。使用時按4:1（V/V）的比例與Leibovtz L-15混合；④胰蛋白酶-Versene液。為5×的貯存液，即將2.5%胰蛋白酶溶液0.5ml加入100ml Versene液中。使用時，用無Ca2+和Mg2+的D-Hanks液將5×的貯存液稀釋到終濃度胰蛋白酶為0.05%，Versene為0.02%；⑤細胞冷凍保存液。95%胎牛血清加入5%二甲基亞楓。

用于黑色素細胞培養牛垂體提取物的制備：

1．稱取牛垂體腺組織25—30g（可于-70℃低溫保存）；

2．解凍并用無菌雙蒸水漂洗垂體組織；

     3．以每克組織加2.38ml冷的0.15mol/L NaCl溶液的比例，在振蕩器上振蕩分散腺垂體組織，使其成為組織碎片，時間不超過30min，并維持其低溫狀態。然后將混合液移入2L的溶劑瓶中；

    4．在2L溶劑瓶中攪動垂體組織90min；

5. 以12000r/min離心45min；

6. 將上清液收集在透析袋中，用1×PBS液于4℃下進行透析。每天更換透析液1次，共透析3d；

7. 用0.45μm的低蛋白結合濾膜過濾去除微小細胞碎片，再用0.2μm微孔濾膜過濾除菌。分裝成每5ml一個包裝單位，于-70℃保存。保存至6個月后才使用。一旦解凍立即加入培養基中使用；

8. 可測定提取物中蛋白質含量，并滴定培養基中最佳提取物用量（大約為40μg/ml）；

實驗方法：

1. 先將皮膚材料用70%的乙醇浸泡30min，再用D-Hanks液沖洗去掉乙醇。然后切開皮膚，用組織剪剪去脂肪和皮下組織，并用外科手術刀片將處理過的皮膚材料切成2mm×3mm大小的皮片；

2. 將切好的皮膚組織皮片移入離心管中，加入表皮消化液，蓋緊，搖勻。于4℃冰箱中孵育18—24h；

3. 棄去表皮分離液，加入D-Hanks液沖洗；

4. 分離表皮（透明層）與真皮（較厚而不透明）。用鑷子夾住皮膚的真皮部分，將表皮面黏貼向干燥的培養皿底，輕柔地沿其表面將真皮組織與表皮剝離；

5. 將細胞分散液滴在分離后的表皮皮片上以免使表皮干燥。用細胞分散液將表皮皮片收集到離心管中，于37℃下，旋轉搖動孵育2—4h（時間長短取決于細胞的分散程度，而搖動可促使游離細胞不斷地從皮片中分離出來）；

6. 室溫下，用D-Hanks液離心洗滌分散細胞懸液3次（每次2000r/min，5min）。洗滌時棄去可能含有膠質層的上清液；

7. 細胞沉淀后，用黑素細胞生長培養基重新懸浮細胞，并進行細胞計數。按2×105個/cm2的細胞密度種植，于37℃、5%CO2條件下培養48—72h；

8. 細胞種植48h后，換液去除未貼壁細胞。以后每周更新培養液2次。如果較多成纖維細胞的生長，可用含200μg/ml遺傳霉素的黑素細胞培養液處理2—3d，以抑制成纖維細胞的生長；

9. 2周內可獲得融合70%的原代培養細胞。將細胞培養物用胰蛋白酶-Versene液在室溫下消化1min.，用含10%胎牛血清Leibovtz L-15培養液終止消化并收集細胞懸液。200r/min下離心3min。用黑素細胞培養液重新懸浮細胞，計數。以104個/cm2細胞密度種植傳代細胞。每周更新培養液2次；

10. PriCells-原代表皮細胞特制基礎培養基；

11. PriCells-原代表皮細胞培養特制添加劑；

12. PriCells-原代細胞分離試劑盒；

13. PriCells-原代細胞鑒定試劑盒；