PriCells: 人骨髓不連續(xù)密度梯度離心用于間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)            

試劑和材料：
1. *培養(yǎng)基：α-MEM：α-*基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過濾除菌。儲存于4℃，不超過2周；
2. 無鈣或鎂的磷酸鹽緩沖液；
3. 無鈣或鎂的Hank′s平衡鹽溶液；
4. Ficoll-Paque淋巴細胞分離液；
5. 聚丙烯離心管，15ml和50ml；
6. 塑料組織培養(yǎng)皿，直徑15cm；
7. 塑料微量移液器槍頭，10μl；
8. 0.85%臺盼藍鹽溶液；
9. 微量離心管；

10. 帶吊桶式轉(zhuǎn)頭的低溫臺式離心機

實驗方法：

1. 去除抗凝管蓋子，將骨髓液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。加入室溫的HBSS，確保體積達到25ml；
2. 取另一個50ml離心管，加入20ml Ficoll-Paque淋巴細胞分離液，將25ml細胞懸液輕輕加到Ficoll上層。HBSS與Ficoll間的界面不能被破壞；
3. 關(guān)閉閘，室溫1800g離心30min；
4. 離心完畢，于Ficoll和HBSS的界面收集白色細胞層，將其移至新的50ml離心管中；
5. 用HBSS將收集到的細胞懸液體積調(diào)整至3倍，室溫1000g離心10min。重復(fù)洗滌；
6. 用30ml預(yù)熱至37℃的CMM重懸細胞；
7. 取10μl細胞懸液加到10μl臺盼藍中，血細胞計數(shù)器評價細胞的存活率，存活率需高于80%；
8. 將30ml細胞懸液移至直徑15cm組織培養(yǎng)皿中，于5%CO_²培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少15h；
9. 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，吸出培養(yǎng)基；
10. 加入20ml預(yù)熱的PBSA，潤洗單層細胞，棄去；
11. 重復(fù)潤洗過程3次；
12. 加入30ml預(yù)熱的新鮮CMM；
13. 每隔一天重復(fù)此潤洗和更新培養(yǎng)基操作，共6天；
14. 6天后，在倒置顯微鏡下觀察單層細胞，貼壁的、成纖維細胞樣MSCs克隆在培養(yǎng)皿中清晰可見。有時可能有造血細胞污染的跡象，但這些細胞可以在傳代時被去除。培養(yǎng)物達到50%—60%匯合時，可以進行MSCs培養(yǎng)物的擴增和凍存；