X-tremeGENE™轉染試劑Protocol和答疑貼

今天Emma女士來和大家一起聊一聊轉染，什么是轉染呢？

 PART 01 認識轉染 

轉染——是指將外源基因如DNA、RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學實驗中，其應用越來越廣泛。

圖  |  常見轉染技術原理

PART 02 常見的細胞轉染技術 

細胞轉染技術主要分為三大類：物理介導法、化學介導法及生物介導法：

物理介導法 

一般是電穿孔法，適用于極難轉染的細胞，如原代細胞，轉染效率高，但轉染后細胞死亡率也很高。

化學介導法 

選用轉染試劑與核酸結合，通過內吞作用進入細胞。一般轉染試劑有以下三種：

• 磷酸鈣：成本低，但轉染效率低，重復性差；

• 陽離子脂質體：轉染效率較高，但脂質體可能改變細胞的結構，對細胞毒性較大；

• 非脂質體試劑：以脂類為主的多組分試劑，轉染效率高，對細胞毒性低，且可生物降解。

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生物介導法 

病毒載體，轉染效率高，但整合到基因組的風險大，基因長度也受限，比較適合構建穩轉的細胞株。

所以，綜合考慮到高轉染效率和低細胞毒性的結合，請看下圖：

X-tremeGENE™360轉染試劑在轉染效率和低細胞毒性方面都勝出了ThermoFisher的Lipofectamine。

相信X-tremeGENE™系列也是大家熟悉的經典轉染試劑，今天Emma女士再來給大家好好聊聊它。

X-tremeGENE™是Roche公司的注冊商標，我司東銳科技今年三月份也榮升為Roche的一級代理商。

X-tremeGENE™系列是非脂質體轉染試劑，此系列轉染試劑可以在含血清培養液中進行轉染實驗，不論是用DNA還是RNA轉染，也不論是轉染普通細胞系或者難轉染的細胞系，都可以很輕松的找到適合的那一款。

請看更詳細的細胞類型對應表：

用GFP編碼的pcDNA3.1質粒或者熒光素酶編碼的pCI質粒轉染細胞的實驗，驗證了以下細胞類型對應的轉染試劑：

?：可以使用；??：推薦使用；???：最佳推薦使用

話不多說，上Protocol干貨！

轉染Protocol以轉染12孔板中單孔細胞的量為例

01 平衡試劑 

X-tremeGENE轉染試劑、DNA和稀釋液平衡至15~25°C，輕輕Vortex轉染試劑；
 

02 稀釋DNA 

用稀釋液稀釋DNA，稀釋液可以選擇無血清或者減血清培養基，稀釋后的濃度為1ug質粒DNA/100ul稀釋液（0.01ug/ul），輕輕混勻；
 

03 分裝稀釋后的DNA 

分別吸取4管100ul（含1ugDNA）稀釋液至四支無菌管中，管上分別標記1:1、2:1、 3:1、和4:1。建議使用無菌離心管或者組織培養處理過的圓底96孔培養板；

重要貼士：zui低稀釋液的量是100ul，如果低于100ul會顯著降低轉染效率；
 

04  混勻轉染試劑和DNA 

分別吸取1、2、3、4ul轉染試劑至剛加入100ul稀釋液（含1ugDNA）的四支無菌管中，對應的標記為1:1,2:1, 3:1, and 4:1，注意轉染試劑不要碰觸到塑料管壁，再輕輕混勻；

重要貼士：避免影響轉染效率，未經稀釋的轉染試劑請不要碰觸到塑料管壁，并不要使用硅化處理的吸頭或者吸管。
 

05 形成轉染試劑/DNA復合物 

將轉染試劑和DNA混合物在15~25°C環境中孵育15分鐘，形成轉染試劑/DNA復合物。

重要貼士：對于某些特殊的細胞系或者低比例的情況可能需要更長的孵育時間，如達到30分鐘。
 

06 轉染細胞 

從培養箱中取出培養容器，培養基可以不進行更換。以一滴滴加入的方式向細胞中加入轉染試劑/DNA的復合物。

重要貼士：對于不同的培養容器，加入復合物的量不同，以12孔板單孔的量為例，每孔中（含1ml細胞培養基）加入100ul轉染試劑/DNA復合物（含1ugDNA）；

加入復合物后輕輕混勻培養皿或者培養瓶以保證復合物的均勻分布，如果條件允許，可以使用搖床低速混勻30秒。

一旦在細胞中加入了復合物，就無需再像其它轉染試劑一樣需要更換新鮮的培養基。
 

07 檢測目的蛋白含量 

轉染細胞后將細胞繼續孵育18-72小時。孵育的時間受許多因素的影響，如DNA載體、細胞類型、細胞密度、細胞培養基和表達蛋白的類型。

孵育之后便可以選擇合適的方式進行蛋白的檢測，如熒光定量或者免疫印跡等。

雖然我們有無比可靠的轉染試劑，但是有時候為什么還是會出現實驗結果不佳的情況呢？

別灰心，這時候我們需要放大雙眼，來看一下Emma女士列出的要點，逐一排除原因，很快就可以做出理想的實驗結果，會給您未來發表的文章增色哦！

PART 03  轉染試劑的技術答疑 

Q：為什么轉染效率不高？

 未優化*佳的轉染試劑與質粒的比例

影響細胞轉染效率的因素較多，主要包括細胞生長狀況、傳代次數、轉染試劑與質粒的比例和孵育時間、質粒大小等，其中轉染試劑與質粒的比例尤為關鍵。

對于不同的細胞類型，轉染試劑與質粒的最佳比例也不同。由于不同細胞表面結構、細胞膜、核膜等結構存在較大差異，同種轉染試劑在不同細胞的轉染效率也不盡相同。

因此，對于較難轉染的細胞如原代細胞、神經細胞，為提高轉染效率，必須對轉染試劑與質粒的比例做進一步優化。

對于X-tremeGENE™系列的轉染試劑，我們建議轉染試劑與質粒的比例按照1:1、2:1、3:1、4:1（ul：ugDNA）四個比例進行測試，選出適合的比例，對于大多數細胞類型，3:1的比例是最合適的。

  細胞的數量不夠 

對于大多數細胞類型來說，建議在細胞密度70%-90%之間進行轉染，過多或者過少都可能降低轉染效率。

  未調整到最佳的孵育時間 

轉染后最佳的孵育時間為18-72小時，對于大多數的細胞類型和質粒來說，最佳的孵育時間是24-48小時。

  轉染效率受培養基某些組分的抑制 

培養基中一些組分如聚陰離子會影響轉染，保證培養基中無這樣的組分。

  轉染試劑/DNA復合物的量過少 

稀釋后DNA的量zui低為100ul，過低的量會顯著降低轉染效率。

Q：為什么轉染后細胞死亡率太高？

 細胞密度不適合 

對于大多數細胞類型來說，建議在細胞密度70%-90%之間進行轉染，過多或者過少都可能降低轉染效率。

  細胞在無血清培養基中進行培養 

對于常規細胞來說，無血清培養基的營養成分不夠，會降低細胞的存活率，雖然roche的轉染試劑可以在無血清培養基中進行轉染，但考慮到細胞需要血清營養成分的供給，應使用正常培養基或者減血清培養基。

  轉染劑/DNA復合物未和細胞混合均勻 

應該將復合物以一滴滴緩慢加入的方式加入細胞培養基中，然后輕輕地前后和左右晃動，使復合物均勻分布。

  使用了內毒素污染的質粒載體 

質粒應該保證是高純度無污染的，可以在提完質粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣可以起到除菌的效果。

  質粒基因產物對細胞有毒害作用 

高表達的質粒基因產物可能會使得細胞本身生長緩慢或者存活率下降。

  使用了過多的轉染試劑/DNA復合物 

陽離子轉染試劑濃度過高時，由于帶有很強的正電荷，對細胞有一定的毒性，導致細胞形態發生變化，細胞大量死亡，所以應降低復合物的濃度或者增加細胞的濃度。

PART 04   研究方向對應篇 

快到文末了，如果您還沒選擇好您的轉染試劑，也可以按照下面的表格來選擇。

（點擊圖片查看清晰原圖）

如果有更多的問題，歡迎聯系我們。

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