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細胞學堂 | 細胞轉染必看的常見問題盤點
細胞轉染是將外源性核酸（如DNA、RNA）引入細胞內的一種技術，它主要用于基因表達、基因編輯（基因敲入/敲除）、蛋白質功能以及細胞功能研究等。簡單來說，通過轉染，我們可以將新的遺傳信息帶入細胞，觀察這些信息對細胞行為的影響。
本期，我們將為大家帶來細胞轉染分類的介紹與常見問題解析，幫助您快速上手，確保細胞轉染實驗順利進行。
細胞轉染分類
根據轉染方式分類
化學轉染：
使用化學轉染試劑（如脂質體、陽離子聚合物等）將核酸包裹并引入細胞。這種方法操作簡便，適用于多種細胞類型。
物理轉染：
利用物理手段（如電穿孔、顯微注射、基因槍等），使細胞膜暫時性開放或直接將核酸注入細胞。這種方法適用于部分難以轉染的細胞類型，但需要專業設備。
生物轉染：
利用病毒載體（如慢病毒、腺病毒等）將核酸導入細胞。病毒轉染效率高，但同時成本高且具有一定安全風險。
根據轉染是否把外源核酸
整合到宿主染色體分類
瞬時轉染：
將外源性核酸引入細胞，使其在短時間內表達目標基因，不整合在細胞的染色體上。核酸在細胞內僅存在較短時間，適合于需要快速獲取數據的實驗，能夠迅速檢測基因功能或表達。
穩定轉染：
將外源性核酸引入細胞，使其整合到細胞染色體中，實現長期表達。通過篩選和擴增，雖然建立過程較長，但提供了穩定的表達系統，適用于生產和長期研究。
細胞培養注意事項
01
如何選擇合適的轉染方法？
目前細胞轉染主要有物理、化學和生物三類轉染方法。物理轉染需要特定儀器、耗材及充分的轉染參數測試，才能獲得較好的轉染效果，一般實驗室無法滿足物理轉染的硬件要求；化學轉染是目前較為通用的一種方法，其憑借價格便宜、操作簡單而被廣泛使用；但部分類型細胞對化學轉染不敏感，轉染效率低，此類細胞可嘗試生物轉染方法，也就是通過病毒進行轉染。但是需要注意的是，如果細胞自身是難轉染類型，即使用病毒感染也不一定會獲得理想的轉染效果。
02
為什么細胞轉染效率不高？
細胞轉染效率不高可能是受到了以下因素的影響：
細胞類型和狀態：轉染試劑對不同細胞的轉染效率不盡相同；轉染前細胞狀態對轉染效率影響較大，此外，細胞密度也會影響轉染效率。
轉染試劑使用量：轉染試劑用量過多或過少都可能影響轉染效果，可根據說明書推薦的使用量進一步梯度摸索，確定目標細胞的最佳轉染條件。
核酸質量：使用的DNA或RNA質量不佳（如降解或污染）會影響轉染效率。
轉染操作：例如制備轉染復合物時孵育時間過長、轉染后的細胞孵育時間不夠等都可能導致效率下降。
03
配制轉染復合物時一定要用無血清培養基嗎？
通常在準備核酸和轉染試劑稀釋液時，建議使用無血清的培養基或轉染試劑自帶的組分。因為血清中含有大量的蛋白質，在轉染過程中，蛋白質可能干擾陽離子脂質體/聚合物對核酸的吸附，影響轉染效率。現在市售的部分轉染試劑進行了一些改進，可以在轉染時使用含血清的培養基，所以配制轉染復合物時，可根據使用的具體轉染試劑說明書，選擇是否使用無血清培養基。
04
電轉后細胞死亡率高，如何調整優化？
細胞狀態：細胞電轉前，保證細胞生長狀態良好，排除細胞污染情況。
細胞密度：確保電轉細胞的密度適中，細胞密度過高或過低都可能影響轉染效果和細胞存活率。
電轉參數：優化電壓、脈沖時間和脈沖次數，針對目標細胞，確定最佳的電轉參數。
電轉緩沖液：使用合適的電轉緩沖液，確保能夠有效導電，同時減少細胞損傷。
05
轉染了抗性基因的細胞加藥篩選后，為什么都死了？
可能是受到了以下因素的影響：
加藥時間：細胞在轉染帶抗性基因的質粒后，需要24-48 h表達抗性基因，避免過早加入藥物進行篩選，一般建議轉染48 h后再加藥，具體時間可以預實驗摸索下。
加藥濃度：若藥物濃度設置過高，超過了抗性基因能夠應對的范圍，導致即使轉染了抗性基因，細胞也無法存活。
抗性基因：抗性基因選擇錯誤或轉染過程中抗性基因發生突變或丟失，都會導致細胞抗性功能喪失。
以上是關于細胞轉染的分類介紹與常見問題解析，更多細胞培養干貨，請持續關注細胞學堂專欄~
