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            武漢普諾賽生命科技有限公司

            內皮細胞培養基配方優化:避免生長不良問題

            時間:2025-5-16 閱讀:355
            分享:

            內皮細胞(Endothelial Cells)是構成血管內壁的單層扁平上皮細胞,形態呈多邊形,細胞的邊緣呈鋸齒狀并相互嵌合,覆蓋于動脈、靜脈和毛細血管的內表面,形成血液與周圍組織之間的機械屏障。作為血管系統的核心功能單元,內皮細胞在基礎研究、疾病模型構建、臨床診斷和藥物篩選等方面具有廣泛的應用價值。


            本期細胞學堂將為您詳細介紹內皮細胞的結構、功能及分離培養步驟,幫助您快速了解內皮細胞,順利展開相關實驗。

             

            01#

            內皮細胞類型的模塊化分布

            內皮細胞并非單一類型,而是根據血管功能與組織需求分化為不同亞型,形成模塊化分布格局。

            連續型內皮細胞(Continuous Endothelium)

            結構特點:

            基底膜連續,細胞間通過緊密連接(如Claudin、Occludin蛋白)形成完整的選擇性屏障。脂溶性小分子可自由擴散,而親水性小分子和水則依賴特定的轉運機制(如水通道蛋白)通過。

            細胞間連接緊密,細胞間隙約為12 ?,大部分物質運輸依賴跨細胞轉運機制(如囊泡介導的白蛋白轉運)。

            細胞收縮性較弱,細胞骨架肌動蛋白分布相對稀疏,整體形態穩定,通透性極低。

            功能:

            維持血腦屏障(BBB)、血-視網膜屏障等結構完整,保護中樞神經系統免受毒性物質侵害。

            典型分布:

            大腦(血腦屏障)、心臟、肺、肌肉、皮膚。

            窗孔型內皮細胞(Fenestrated Endothelium)

            結構特點:

            細胞表面存在直徑約200-1000 ?的窗孔,大部分覆蓋由 PV-1蛋白形成的非膜性隔膜。這種結構增加了細胞對流體和溶質的通透性,但同時限制了大分子通過。

            基底膜連續,允許小分子和液體的快速交換。

            糖萼層在窗孔型內皮表面較為稀疏,其殘留結構仍可能參與微環境的調節和溶質交換的選擇性控制。

            功能:

            參與物質高效濾過(腎小球)、激素分泌(胰島毛細血管)和營養吸收(胃腸道黏膜)。

            主要分布:

            腎臟(腎小球)、內分泌腺(如胰島)、胃腸道黏膜。

            不連續型/竇狀內皮細胞(Discontinuous/Sinusoidal Endothelium)

            結構特點:

            基底膜不連續或缺失,細胞間間隙較大,可達0.1-1 μm。這種結構支持大分子(如脂蛋白)和血細胞跨內皮轉運,使其能夠進入實質組織。

            細胞間連接較松散,可在局部信號(免疫分子、機械應力)影響下調節血管孔隙大小,參與動態過濾功能。

            功能:

            高通透性結構支持大分子和血細胞交換,并在肝臟等器官中承擔免疫清除與調節功能。

            主要分布:

            肝臟、脾臟、骨髓等器官的血竇系統。

             


            02#

            內皮細胞功能模塊化體系

            不同組織中的內皮細胞通過調整連接方式的組成和比例,適應其特定的生理需求,從而維持血管系統的正常功能。

            連接方式

            緊密連接

            由跨膜蛋白(如Occludin、Claudin)與胞質錨定蛋白(如ZO-1)形成選擇性屏障,限制細胞間隙中溶質的被動擴散,在血腦屏障等關鍵部位發揮核心作用。

            縫隙連接

            由 Connexin 蛋白構成,允許相鄰細胞間直接傳遞離子、小分子及第二信使,實現細胞功能的快速協同,如鈣信號和代謝物的同步傳播。

            黏附連接

            通過鈣黏蛋白(如VE-cadherin)與肌動蛋白骨架結合,維持細胞間機械穩定性,并參與白細胞黏附與跨內皮遷移,調控炎癥和免疫應答過程。

            分子標志物

            功能模塊

            標志分子

            血管張力調節

            舒張因子:一氧化氮(NO)、前列環素(PGI2)

            收縮因子:內皮素-1(ET-1)、血栓素A2(TXA2)

            凝血與纖溶

            抗血小板聚集:NO、PGI2

            纖溶:組織型纖溶酶原激活物(tPA)

            抗凝:肝素樣糖胺聚糖(Heparan sulfate proteoglycans)、肝素輔因子II(Heparin cofactor II)

            促凝:血管性血友病因子(vWF)、血小板活化因子(PAF)

            炎癥與免疫

            黏附分子:細胞間黏附分子(ICAM-1/VCAM-1)

            抗菌肽:防御素β(Defensin-β)

            細胞因子:白介素37(IL-37)

            血管生成與修復

            促血管生成:內皮生長因子A(VEGF-A)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)

            促血管修復:血管生成素-1(Ang-1)、轉化生長因子-β(TGF-β)

            維持血管結構

            內皮標志物:CD31、鈣粘蛋白(VE-cadherin)

            結構指標:微血管密度(MVD)

            功能響應

            物質交換功能

            所有類型內皮細胞均參與氧氣、營養物質和代謝廢物交換,依其結構采用跨細胞或旁細胞通道,如連續型內皮細胞主要跨胞機制(如囊泡介導轉運)實現物質交換。

            力學響應性

            剪切應力可激活內皮型一氧化氮合酶(eNOS),促進一氧化氮(NO)釋放,以擴張血管,維持血流動力學穩態。

            穩定的脈動血流能夠抑制炎癥因子表達,防止內皮激活與功能紊亂。

            病理可塑性

            在氧化應激、炎癥等病理條件下,內皮細胞可發生功能障礙,表現為通透性增加、黏附分子表達上調等。這些變化參與了動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變等多種病理過程。

            異質性中的統一性

            盡管不同組織器官間內皮細胞結構和功能上存在差異顯著,但它們普遍表達一些共同的標志物(如CD31、VE-cadherin),表現出一定的統一性。

            內皮細胞具有極性特征,頂端朝向血腔,基底面通過整合素等受體與基底膜結合,從而維持血管結構的完整性。

             


            03#

            內皮細胞的分離提取與培養

            以分離人臍靜脈內皮細胞為例,操作步驟如下:

            01 血管處理

            臍帶采集與清洗

            采集新鮮臍帶,用無菌PBS沖洗去除表面血液。

            血管識別與分離

            沿臍帶縱軸切開,識別單根臍靜脈(其直徑較大、壁薄,與兩條較厚且呈螺旋排列的動脈區分)。用鑷子進行鈍性剝離,去除周圍結締組織。

            血管清洗與封閉

            為防止殘留紅細胞和凝血-塊影響后續操作,用預冷PBS反復灌洗血管至流出液清澈(通常需5-8次)。隨后,用無菌手術夾封閉血管一端,另一端連接注射器,形成封閉系統以控制酶處理范圍。

            02 消化與收集

            將HUVEC專用消化酶緩慢注入血管,確保內腔充盈。隨后將血管置于37℃孵育10-15 min(注意:孵育時間不宜過長,否則易導致細胞死亡)。消化結束后,為防止消化液流出受阻,先用鈍頭針頭疏通血管下端流出口,隨后松開下端手術鉗,消化液流入一個含有內皮細胞完-全培養基的50 mL 無菌離心管中,再用完-全培養基沖洗血管內腔,收集洗脫液。將收集液以150 × g離心5 min,離心結束后,分離的內皮細胞聚集于離心管底部。小心棄去上清液,避免擾動細胞沉淀。

            03 接種與傳代

            用完-全培養基重懸細胞,并將細胞接種到預涂纖維連接蛋白、明膠或基底膜基質的培養瓶,促進內皮細胞貼壁和鋪展,培養24-48 h后觀察細胞貼壁情況,換液后可見典型“單層扁平排列樣"內皮細胞形態。

            04 常見問題與解決方案

            問題

            可能原因

            解決方案

            細胞得率低

            酶消化不充分

            優化消化酶濃度,延長孵育時間

            成纖維細胞污染

            血管外膜未徹-底剝離

            鈍性分離時避免損傷血管中膜

            細胞貼壁率低

            基質涂層不均勻

            預涂纖維連接蛋白

            細胞提前衰老

            傳代次數過

            限制傳代(≤5代)

            氧化應激反應

            添加抗氧化劑(如NAC)


             


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            圖片


             


            圖1. 大鼠腎小球內皮細胞形態觀察(A-B);CD31免疫熒光染色(C-D)和生長曲線(E) 

            與S品牌ECM產品相比,使用普諾賽®內皮細胞完-全培養基ECM培養的細胞在形態、純度和增殖效率方面表現一致,同時普諾賽®ECM產品具有更高的性價比。

            以上是關于內皮細胞的結構、功能、分離培養步驟及注意事項的解析。為幫助大家更好地開展相關研究,普諾賽®提供了原代內皮細胞、內皮細胞完-全培養基EpiCM以及原代細胞通用完-全培養基,一站式培養細胞,助您科研無憂!更多細胞培養干貨,請持續關注細胞學堂專欄~


             


            參考文獻

            [1] Ricard N, Bailly S, Guignabert C, Simons M. The quiescent endothelium: signalling pathways regulating organ-specific endothelial normalcy. Nature Reviews Cardiology. 2021;18(8):565-580.

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