蛋白樣品的制備與定量

（1）提細(xì)胞蛋白 

① 消化或刮下細(xì)胞至 1.5 的 EP 管中，標(biāo)記，10000r 離心 2min，PBS 洗 3 遍

② 吸去 EP 管中 PBS，最好用濾紙吸干里面的水分，加適量 RIPA 裂解液（RIPA 裂解液：蛋白酶抑制劑=250:1），如果你想做信號(hào)通路指標(biāo)還得再加上磷酸酶抑制劑（磷酸酶抑制劑： RIPA 裂解液=1:1000） 

③ 冰上裂解 30min~1h，開(kāi) 4°離心機(jī) 

④ 4°離心 11000r，20min 

⑤ 測(cè)蛋白濃度，取上清，加蛋白上清的四分之一體積 5x 上樣 loading buffer，煮沸，分裝（蛋白質(zhì)變性）

（2）提組織蛋白 

① 研缽中倒入液氮，加入組織塊，研磨，加液氮，藥匙刮 

② 刮下后放入 1.5ml 的 EP 管，加適量裂解液，吹打 

③ 冰上放置 1h，期間，每隔 10~15min 吹打一次，開(kāi) 4°離心機(jī) 

④ 4°離心 10000r，1h 

⑤ 測(cè)蛋白濃度，取上清，加 1/4 體積 5x loading buffer，煮沸，分裝

（3）測(cè)蛋白濃度（BCA 法） 

① 八個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔，按說(shuō)明書(shū)先加超純水，再加標(biāo)準(zhǔn)蛋白液 

② 目的孔，每孔加 18ul 超純水+2ul 目的蛋白 

③ 按說(shuō)明書(shū)配 BCA 工作液，每孔加 200ul 

④ 37°放置半小時(shí)后測(cè)濃度

（4）計(jì)算上樣量，設(shè)計(jì)上樣順序 

上樣體積：上樣量/濃度 x 5/4

上樣順序：無(wú)處理，對(duì)照，處理；體積最好不要相差太大

經(jīng)驗(yàn)總結(jié)： 

如何提高蛋白濃度：首先當(dāng)然是多種點(diǎn)細(xì)胞啦，其次可以少加點(diǎn)裂解液，盡量裂解充分。如何處理蛋白濃度低的問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)蛋白的濃度太低，如果上樣的話，體積太大，甚至電泳孔都裝不下，舉例：假設(shè)我需要上樣 40ul 才能達(dá)到 20ug，那么顯然按照常規(guī)的方法，10 孔的梳子只能加 25ul 左右，我們此時(shí)可以取 40ul 蛋白入 EP 管中，放置于 PCR 儀器，變性溫度濃縮蛋白體積，這樣不斷濃縮之后促使 EP 管中蛋白的水分降低，蛋白量依舊是 20ug。如何保證對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白濃度大概是一致的：種植細(xì)胞的時(shí)候盡量保持鋪下去的細(xì)胞數(shù)接近，收細(xì)胞之后觀察細(xì)胞的多少適當(dāng)加入幾倍體積的裂解液。