實驗分享：血腦屏障實驗的操作步驟

從19世紀末，保羅·埃爾利希在一個實驗中發現了這個屏障，后期科學家跟進研究后發現血腦屏障（BBB）對機體發揮著重要作用。BBB結構和功能的完整對于維持神經元功能，使中樞神經系統免受病原體、炎性因子、損傷的影響有重要意義。缺血性腦血管病的發生、發展與BBB結構和功能的破壞密切相關。

一． 實驗試劑準備：

1. 準備好無鈣鎂離子PBS磷酸鹽緩沖液，cell systems人腦微血管內皮細胞（貨號：ACBRI 376)建議使用無鈣鎂離子的緩沖液實驗.

2. 通過稀釋 0.5 mg/mL 纖維素溶液和 0.3 mg/mL 膠原蛋白 IV 溶液，在 1.5 mL 微管中分別使用 1x PBS 至 100 mg/μL 等分，制備 10 μg/mL 膠原蛋白 IV 和 10 μg/mL 纖維素溶液。此后，將兩種等分的100μL與1，800μL的1x PBS混合在2 mL微管中，并將其儲存在-20°C。也可使用cell systems原代細胞專用包被液（貨號：4Z0-201），鋪板后靜等2分鐘，吸掉包被基質，直接鋪板細胞，節約時間，簡單方便。

3. 預備好培養基，cell systems原代細胞經典培養基(貨號：4Z0-500)包含包被液和生長因子，并且不含抗生素。

4. 準備胰酶，在 50 mL 管中稀釋 45 mL 的 1x PBS 的 10x 濃縮胰蛋白酶-EDTA 溶液的 5 mL，制備 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液并將其儲存在 4°C，也可以cell systems傳代套裝（貨號：4Z0-800),包含PBS，胰酶，胰酶中和液，一套解決所有消化試劑的準備問題。

5. 在 500 mL 玻璃瓶中稱量 10 g LB 肉湯，制備 500 mL LB 介質。加入500 mL的消毒水，并高壓滅菌。

6. 在 500 mL 玻璃瓶中稱量 10 g LB 肉湯和 7.5 g 的瓊脂，準備 LB 瓊脂。在高壓滅菌前加入500 mL的消毒水，不要關閉燒瓶蓋。高壓滅菌器，讓溶液冷卻，直到可以接觸。

二.血腦屏障細胞的生長

1. 使用12 孔板，請將細胞包被液種到孔里。

2. 將板和每個刀片解壓在生物安全柜中，并在那里執行進一步步驟。使用消毒鉗抓住刀片在其寬基上移動它。

3. 用90μL的10微克/mL膠原蛋白IV和10μg/mL纖維蛋白混合物覆蓋每個刀片的多孔膜。之后放入細胞培養箱中孵育24小時，在37°C下孵化。

4. 將 1 mL 的 1x PBS 移入每個刀片，然后用真空泵吸出溶液，用于細胞培養，將刀片洗滌兩次。

 注意：若使用cell systems細胞包被液，前三的步驟可省略為：使用移液管將包被液移入孔板里，靜等2分鐘后吸出，無需清洗，直接執行第四步。

5. 通過在上部移液 0.5 mL 的預熱 cell systems經典細胞培養基和下腔室的 1.5 mL 來平衡膜。在具有5%CO2大氣的細胞培養箱中，在37°C下孵育30分鐘

6. 種子2 x 105人類微血管內皮細胞進入每個上腔，并在細胞培養箱中以37°C孵育12孔板。

7. 使用真空泵從細胞培養液中吸出培養基，然后通過移液 10 mL 的 1x PBS 清洗單層，然后用真空泵對溶液進行吸氣。

8. 將5ml的培養基吸出培養瓶，用1x濃縮胰蛋白酶-EDTA*覆蓋細胞。在細胞培養箱中37°C下孵育燒瓶3-5分鐘。注：如果細胞未分離，請輕拍培養瓶讓細胞脫落。

9. 加含有血清的培養基中和

10. .在 210 x g下將懸浮液離心 3 分鐘，用真空泵去除上清液，用移液器將細胞重新懸浮在 5 mL 的培養基。

11.  將細胞懸浮液的10μL與10μL的0.4%臺盼染色劑混合在1.5 mL微管中，使用細胞計數器。將10μL的混合物加入計數室滑塊，放入細胞計數器，然后開始計數。

12. .將計數器聚焦在單元格上，使其邊緣為深藍色和中間白色。之后，啟動適當的細胞計數程序。

13.要計算每個刀片的體積，請將每刀片獲得的 2 x 10^5個單元格的細胞懸浮液的計算濃度分開。

三. 血腦屏障模型的培養

在37°C下孵育12孔板14天。

上腔室的培養基每天更換 0.5 mL，下腔培養基每 2-3 天更換 1.5 mL。在更換培養基之前，請先預熱。真空泵吸氣，避免產生氣泡注意：小心工作，避免接觸膜。

通過顯微鏡成像細胞，檢查細胞的狀態，并確定匯合。確保14天后匯合度為100%。

四. 細菌的制備

1. 測量前一天，將大腸桿菌菌株的菌群復蘇在LB培養基里。在37°C下孵育培養24小時，在孵育搖床中孵育180rpM

2. 在 4°C 的 LB 瓊脂板上培養大腸桿菌菌株。取一個帶消毒的采摘管，并將采摘放入具有 3 mL LB 瓊脂培養基制備的培養管中。

3. 為每個刀片準備一個 LB 瓊脂板，并填充培養皿，將其總體積減半。讓他們變成固體，并存儲在4°C。

五.  細胞的藥物實驗

1. 播種后的第14天，用化合物處理細胞或測量轉皮電阻（TEER），。

2. 要是由感興趣的化合物處理細胞，將該化合物稀釋到調整好濃度稀釋到*培養基中。將0.5 mL的混合物加入上腔室，將1.5 mL添加到下腔。再次進行培養。之后，通過真空泵吸氣和移液進行正常的細胞換液處理。

六. 滲透性測量

1. 為了獲得恒定的細菌濃度，用波長為600納米的光度計測量光密度。用LB培養基在50 mL falcon管中將過夜的細菌溶液稀釋至OD600為0.5±0.05。在冰上工作。

2. 向比色皿中加入1毫升LB培養基。啟動光度計，將比色杯放入，標記側朝前。按下底部“空白"，然后測量空白值。

3. 將細菌溶液注入比色杯中，放入比色杯中，然后按壓底部樣品，測量細菌溶液的密度。在稀釋過程中重復測量，直到獲得最終濃度。

4. 在生物安全柜中工作，可使用準備好的12孔板和OD600=0.5的細菌溶液處理細菌。僅向每個含有0.5 mL培養基的上腔中添加450µL細菌溶液。

5. 在37°C的培養箱中培養12孔板6小時。

6. 用移液管從每個下腔取50µL培養基樣品，方法是用鑷子取下插入物。注意不要將培養基從上腔濺到下腔。

7. 將每個樣品置于單獨的瓊脂平板上。將樣品滴在平板上，用細胞撒布器劃出溶液。

8. 在37°C的培養箱中培養瓊脂平板24小時。

9.計算每個平板中的菌落數

CELL SYSTEMS血腦屏障部分參考文獻：

1."Cysteinyl leukotriene receptor type 1 antagonist montelukast protects against injury of blood–brain barrier" Zhou et al. Inflammopharmacology, 2019

2."Alterations of the Endocannabinoid System in Post-ischemic Endothelial Cells of the Blood Brain Barrier" Thurston (Dissertation) 2019

3.Exosome-Mediated Transfer of ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme ） from Endothelial Progenitor Cells Promotes Survival and Function of Endothelial Cell" Wang et al. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020

4."RAGE and CCR7 mediate the transmigration of Zika-infected monocytes through the blood-brain barrier" Costa de Carvalho et al. Immunobiology, 2019

5."Binding Heterogeneity of Plasmodium falciparum to Engineered 3D Brain Microvessels Is Mediated by EPCR and ICAM-1" Bernabeu et al. mBio, 2019

6."In Vitro Cell Models of the Human Blood-Brain Barrier: Demonstrating the Beneficial Influence of Shear Stress on Brain Microvascular Endothelial Cell Phenotype" Rochfort and Cummins et al. Blood-Brain Barrier, 2018

7."Modulation of glucocorticoid receptor in human epileptic endothelial cells impacts drug biotransformation in an in vitro blood–brain barrier model" Ghosh et al. Epilepsia, 2018.