劃痕實驗（細胞遷移）的實驗流程及經驗分享

簡介：
細胞遷移(Cell migration)：因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實驗(Wound healing assay)，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的梯度后而產生的移動。可用于可以觀察藥物、基因等外源因素對細胞遷移、修復和相互作用的影響。
 

原理：
在融合的單層細胞上人為制造一個空白區域，稱為“劃痕/傷口"，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使“劃痕/傷口"愈合，于細胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像，通過測量不同時間點的劃痕間距并計算差值，可對細胞的遷移能力做出判斷。

材料及儀器：
耗材：六孔板、馬克筆、直尺、200ul槍頭、PBS、（血清）細胞培養基等。

實驗步驟：

1.劃線：于六孔板底面，馬克筆順直尺畫三條橫線作為標記線。

2.種板：根據分組種板，細胞密度為5x105個/孔左右。并務必鋪勻。

3.劃痕：待細胞長滿后，用直尺比著，200ul槍頭垂直于孔板和畫的標記線劃兩條垂線，使劃痕與標記線相交，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點。

4.清洗：棄去舊培養基，用PBS輕輕潤洗兩到三次，直到劃下來的細胞沖洗干凈。

5.加液：根據分組分別加入加藥培養基或無血清培養基。

6.拍照觀察：劃痕、清洗、加液完成后，用顯微鏡拍不同倍數的照片，作為0h對照。放入37℃，5%CO2培養箱中培養。在所需時間點取出細胞，于顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照。

7.數據分析：一種是統計細胞遷移的距離，一種是統計劃痕面積。都可以用ImageJ軟件來進行分析。

注意事項或經驗分享：

1.直尺和馬克筆等工具用前務必照紫外消殺。
2.種板所用細胞數目可根據細胞的生長快慢調整接種數量。保證每組細胞鋪板密度一致，保證每孔務必鋪勻。
3.提前用馬克筆畫好線，避免細胞種板后不好操作。槍頭畫線之前，不要棄去原培養基，否則劃下來的細胞團塊會堆積在劃痕邊緣上堆積導致寬度不統一。
4.用槍頭畫線時，要用力均勻一致，垂直穩定一氣呵成，避免寬度差別較大不利于結果分析的準確性。
5.根據交叉點定位拍照，避免了前后觀察時位置不固定的問題，結果更有說服力。
6.務必清洗干凈劃下來的活細胞，避免在拍照期間細胞貼壁在劃痕處并進行增殖影響結果。
7.0h拍照時可以在試驗記錄本上標記拍照位置，以便下各時間段拍攝同一位置。
8.拍照時注意不要露出馬克筆畫的線條，不要鏡頭過于模糊，盡量不要選擇邊緣的光影差別過大的位置，切換鏡頭時不要忘記換標尺，否則都會影響結果的自動分析。
9.根據細胞種類，選擇無血清或低血清培養基來降低細胞增殖的影響，或用Mitomycin（1μg/ml）處理1h，抑制細胞的分裂，消除增殖的影響。但同時也會影響細胞遷移的速度。
10.一般拍照時間為0，2，4，6，8，10，12，16，24小時等選取，不建議超過24h，過度增殖造成實驗假陽性結果。
11.手工劃痕可能難以保證寬度一致性，culture Insert是現在市面上也推出的一種可以提前占據劃痕區域的模具，將細胞接種于Dish中間的Insert培養，細胞長滿Insert區域后用鑷子移除Insert產生筆直且無細胞損傷的劃痕。
12.分析結果中長度法，由于細胞遷移并不是齊頭并進的，可能組間差異大，建議用平均多條距離的值來代表。

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