永生化人腦微血管內皮細胞（HCMEC/D3）培養指南

簡介：

 HCMEC/D3細胞系來自于癲癇患者手術切除的富含腦內皮細胞（CECs）的組織，并從中分離出人顳葉微血管。后續使用人端粒酶（hTERT）和SV40大T抗原的催化亞基通過慢病毒載體轉導，使細胞依次永生化后，通過有限稀釋克隆法選擇性分離CEC，最終鑒定所得的細胞，具有廣泛的腦內皮細胞表型特征。可表達大量內皮細胞；可在基質膠上形成毛細血管樣結構；可作為人血腦屏障（BBB）模型。可用于研究內皮細胞，血管，藥物攝取與主動轉運機制等。

培養條件：

 內皮細胞專用基礎培養基-EMC培養基+5%FBS+1%內皮細胞生長添加物和1%青霉素/鏈霉素溶液。置于37°C，5%CO2的培養箱中培養。

消化（10cm皿為例）：

1. 當單層培養細胞匯合達80%。

2. 棄去舊培養基，2mlPBS潤洗兩次。

3. 用1ml含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培養箱放1min，然后鏡下觀察變圓）。

4. 用1ml（血清）細胞培養基終止消化，九宮格法吹落細胞收集到離心管，以800-1000rpm，室溫離心5min。

傳代：

以1:2~1:3的比例傳代，離心棄去廢液，用2ml~3ml（血清）細胞培養基充分重懸細胞沉淀成單個細胞，以“"Z“"字打入含有7ml培養基的10cm培養皿中，輕柔十字晃勻不超過十下并靜置數分鐘后鏡下觀察，平穩放入培養箱中。

凍存：

1. 凍存液的配置為血清：二甲基亞砜(DMSO)=9:1。

2. 取長勢良好，匯合度達80%-90%并無污染的細胞，消化離心后用1.5ml凍存液重懸后轉移至凍存管中，標記好細胞種類、日期、操作者，放入恢復室溫的梯度凍存盒，一同放置于-80°C冰箱。

復蘇：

準備好離心管中放入3ml（血清）細胞培養基，并確保水浴鍋打開并達到37°C，從-80°C冰箱取出目標凍存管，放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min，與3ml培養基混合均勻。在1000rpm，離心5分鐘，棄去上清液，用新培養基重懸細胞為單個細胞狀態，加入10cm皿中，培養過夜。

注意事項：

1.ECM細胞培養基又稱內皮細胞培養基，是專門為人類微血管內皮細胞體外培養設計的最合適其生長的（血清）細胞培養基，包括必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和低濃度胎牛血清（5%）。

2.該培養基的配方能夠選擇性的促進正常人類微血管內皮細胞體外培養中的增殖和生長。

3.嘗試過使用DMEM（高糖）培養基、M199培養基，考慮可能由于不含生長因子，多代后細胞形態發生改變，碎片增多。

4.ECM細胞培養基中的數種成分是怕光的，所以推薦培養基不要長時間暴露在光中。避光4°C保存，配好的培養基需要在一個月內使用。

5.HCMEC/D3細胞十分耐造，正常培養即可。

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