質粒構建的心得分享

質粒是我們日常實驗中比較常用的載體，其可以自主生長，也能通過比較容易的方法進行大量擴增，但往往單一的質粒不能滿足實驗需求，需通過一系列方法進行質粒重組，我目前比較常用的方法也就是比較陳舊的酶切重組質粒的方式，簡易實驗過程如下圖：

在這個過程中，有幾個小Tips：

1.原載體的酶切位點由文獻、載體說明書或者導師建議得來，選擇正確的酶切位點是重組質粒開始的第一步，常見的酶切體系如下：

上述體系適用于大多數酶切，不是特別難切開的載體1μl內切酶足夠，酶切前計算好量，先加ddH2O，最后加內切酶。

2.酶切完成后，需要跑瓊脂糖膠鑒定酶切效果，配膠時注意選擇合適的膠濃度，原則是分子量越大，膠濃度越小。跑膠完成后紫外燈下一般會有兩段即為成功：載體和切下來的片段，根據結果進行膠回收，注意切下來的片段不回收，膠回收完成后測濃度備用。

3.插入片段根據自己的實驗選擇，通常插入片段可以通過PCR而來，或者是一段由三方公司合成的序列，在連接開始前也需要用同樣的兩個內切酶切出缺口。常見連接體系如下：

其中，加入載體和插入片段的量由說明書得來，加樣前計算好量，先加ddH2O，最后加連接酶，由于連接體系較小，一般使用pcr管進行。

4、為確保連接的順利進行，務必保證連接酶和連接酶緩沖液配套使用，即使用同一廠家的，不能混用。

測序的準確性對于后續慢病毒感染是非常重要的，因此測序公司的選擇十分重要，尤其出現一些比較難測的結構如shRNA的發卡結構等，測序技術不成熟的話會一直報重疊峰或者測不通的情況。

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