24條細胞培養經驗

什么是細胞培養？

細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。

不論對于整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個非常重要的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術中十分重要的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。

細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

細胞培養總會遇到細胞污染、胞質疏松，狀態不好，養不起來等等問題。接下來就給你們介紹一些常見問題解決方法。

細胞培養的菜鳥問題集

1.冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

2.細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO？

除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入10-15ml新鮮培養基，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3. 可否使用與原先培養條件不同的培養基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞可能無法立即適應，導致細胞狀態不好甚至死亡。

4. 可否使用與原先培養條件不同的血清？

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5. 培養細胞時應使用多少濃度的CO2？5%還是10%，或根本沒有影響？

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時，細胞培養時應使用10% CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應使用5% CO2 培養細胞。

6. 何時須更換培養基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。

7. 培養基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素，但實際操作中有時會加入1%的青鏈霉素來避免細菌污染。

8. 貼壁細胞繼代時該使用多少濃度的trypsin-EDTA？

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一般使用濃度為0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。

9. 懸浮細胞應如何繼代處理？

一般僅需在原培養瓶中持續加入新鮮培養基，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多，可將培養瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞的培養液至另一新的培養瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

10. 一般動物細胞的離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為300 g (約1,000 rpm)，5-10分鐘，過高轉速將造成細胞死亡。

11. 合適的細胞接種密度是多少？

依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦可能會導致細胞生長過慢。

12. 細胞冷凍培養基的成份是哪些？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95 %原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成、且需提前放在4 °C預冷。

13. DMSO的等級和無菌過濾方式？

冷凍保存使用的DMSO等級必須為Tissue culture grade，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，避光保存。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO的Nylon材質濾膜。

14. 細胞凍存的步驟是什么？

凍存方法一：冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

凍存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C至–80 °C以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，但存活率會降低。

15. 凍存時細胞密度為多少比較合適？

冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106cells/ml vial為宜。

16. 應如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。造成細胞污染的主要原因有無菌操作技術不當、操作室環境不佳、實驗耗材污染、血清污染和細胞來源污染等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環境和品質良好的細胞來源是避免污染的最好方法。

17. 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？

直接滅菌后丟棄之。

18. 支原體污染會對細胞培養有何影響？

支原體污染幾乎可影響細胞所有的生長參數。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果方有意義。

19. 偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？

直接滅菌后丟棄是最佳的方法，以避免污染其它細胞株。但如果樣品比較珍貴，可以購買市面上現有的支原體去除試劑，嘗試拯救一下。

20. CO2培養箱的水盤如何保持清潔？

定期更換無菌蒸餾水或無菌去離子水(至少每兩周一次)。

21. 為何培養基保存于4 °C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養基保存在4 °C冰箱中， 培養基內的CO2會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中的酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。

22. 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，但對大部分細胞沒有太大之影響，只有少數細胞可能會因使用不同廠牌的dish或flask而表現出生長差異。

23. 購買的細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少的情形？

研究人員在解凍細胞后出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

24. 購買的細胞出現死亡率高或狀態不佳的可能原因？

研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C太久。

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