PCR引物設計原則

1、引物長度一般在15-30bp

引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74°C，不適于Taq DNA聚合酶進行反應；

2、引物GC含量一般為40%-60%

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量為高或過低都不利于引發反應。上下游引物GC含量過高或過低都不利于引發反應。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應的模版序列的Tm值最好在72°C左右

Tm值在72°C左右可使復性條件最佳，至少要在55-80°C之間。Tm值在72°C左右可使復性條件最佳，至少要在55-80°C之間。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4（G+C）+2（A+T），在Oligo軟件中使用的是最鄰近法（the nearest neighboor method）;

4、引物3'端的堿基一般不用A

引物3'端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。

5、引物3'端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。

6、引物3'端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。

7、如擴增編碼區域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率；

8、引物5'端可以修飾

引物5'端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

9、堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補。

引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構(Hairpin)使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross Dimer)的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高(應小于4.5kcal/mol)。否則易導致引物二聚體帶的產生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

10、引物的AG值最好呈正弦曲線形狀，即3'端AG值較低，而5'端和中間ΔG值相對較高。AG值(自由能)反應了引物與模板結合的強弱程度，一般情況下，引物的AG值最好呈正弦曲線形狀，即3端AG值較低，而5端和中間AG值相對較高。3'端的AG值相對要低，且絕對值不要超過9引物的3'端的AG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。

11、引物應在核酸保守區內設計并具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。

以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務。