石蠟切片HE染色實驗

蘇木精-伊紅染色法 ( Hematoxylin-Eosin staining )，簡稱HE染色法，切片技術里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使用細胞核內的染色質與胞質內的核糖著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。

實驗步驟：

1.取樣固定

取新鮮的組織樣品，加入4%多聚甲醛組織固定液的EP管中。取樣材料應該小而薄，約黃豆粒大小。

2.脫水

采用梯度酒精濃度法脫水。通常選擇50%-60%-70%-90%-95%-100%的濃度梯度，各酒精濃度要求準確，95%以前各步驟脫水1h，95%和100%均分為兩步進行，分別脫水30min，實驗中常將組織在后一步的95%的酒精溶液中過夜，以便進行脫脂。

3.透明浸蠟

為了使石蠟更容易進入組織，要對脫水后的組織進行透明處理，二甲苯：無水乙醇（1:1）溶液和二甲苯透明樣品各30ml，在60°C的石蠟溶液中充分浸泡2h。

4.包埋和切片

通過包埋機，將浸泡后的組織塊使用蠟液包埋后，放到冷臺上凝固，之后使用刀片進行修整，在切片機上固定好后進行連續切片（5um），所得的切片用銀子在42°C溫水中展開，之后固定在載玻片上，經40°C烘干后進行HE染色。

5.HE染色

HE染色的程序是將切片浸入二甲苯ⅠⅡ，95%酒精，90%酒精,80%酒精,70%酒工各15min.二甲苯:100%酒精(1 :1),100%酒精Ⅰ,50%酒精,蒸餾水各2 min,蘇木精染液5~10 min,水洗后分化入1%鹽酸酒精5 s,自來水10min,1%氨水藍化,自來水,50%,70%,80%,90%和95%酒精各2 min,伊紅染液5 min,95%酒精,100%酒精ⅠⅡ,100%酒精:二甲苯(1: 1),二甲苯I、各2 min。中性樹脂封片，不應該等切片上的二甲苯干了再封固。

注意事項：

染色過程需要優化，染色狀況與組織或細胞的種類有關，也隨著生活周期及病理變化而改變；

①固定時要注意組織在固定液中的位置,并且隨時翻動組織,使其充分固定。

②若組織脫水不凈時，則會造成隨后的透明和浸蠟過程中二甲苯和石蠟液無法滲入組織,所以應該保證脫水液體的濃度,并經常更換新溶液。

③透明：一般30分鐘就可達到透明的程度，但溫度較低時可適當延長時間或置于溫箱中加熱。

④浸蠟、包埋：浸蠟和包埋要盡量在恒溫下操作，防止中間出現溫度差，蠟的溫度要適宜，蠟塊中不能出現氣泡、裂隙?斑點?對于碎小組織要盡可能使其處于同一平面，否則會造成切片不全與漏切。

⑤切片：在夏季切片時，為保持蠟塊硬度，可把蠟塊放于冰柜中切時取出組織蠟塊四周在切片前應修齊大小適當。不宜過重過猛，容易造成切片厚薄不均，甚至毀壞蠟塊。

⑥染色：染色前切片脫蠟要透徹。染色時間要根據染液的新舊適當調整，必要時在染色過程中用顯微鏡觀察，染色過程中避免陽光照射。染色過程中水沖洗不宜太猛。

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