慢病毒制備和導入細胞的操作步驟及注意事項

前置知識

通過病毒介導將核酸導入哺乳動物細胞是一種常用的實驗技術，被廣泛用于基因傳遞、基因表達和功能研究等領域。這個實驗通常分為以下6個部分：

1.選擇適當的病毒載體：常用的病毒載體包括腺病毒（Adenovirus）、腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）和逆轉錄病毒（Retrovirus）。

2. 構建表達載體：將目標核酸（例如基因、RNA等）插入到病毒載體的適當位點上，構建表達載體。這通常涉及將目標核酸序列克隆到適當的表達載體質粒中，并進行驗證和測序。

3. 病毒包裝和擴增：將構建好的表達載體轉染到特定的包裝細胞中，這些細胞能夠產生具有完整病毒基因組的病毒顆粒。病毒顆粒可以通過細胞培養和病毒擴增過程進行大規模生產。

4.細胞轉染：將目標哺乳動物細胞培養在培養皿或培養板中，然后將病毒顆粒加入培養基中與細胞進行共培養。病毒顆粒會與細胞表面的受體結合，并進入細胞內部。

5.核酸導入和表達：一旦病毒進入細胞內部，它會釋放出核酸負鏈，該負鏈會被細胞核內的轉錄和翻譯機制利用。目標核酸的表達產物（例如蛋白質）會在細胞內合成，并根據實驗需要發揮其功能。

6.實驗分析：根據實驗目的，可以對細胞和表達產物進行進一步的分析。這可能包括檢測蛋白質表達水平、功能研究、細胞行為觀察等。

操作步驟

A 慢病毒制備：

1、提前一周復蘇293T細胞，使用10% FBS-DMEM培養基傳代3次以上。

轉染前一天將生長狀態良好的293T細胞用0.25%胰酶消化，得到細胞懸液，計數，然后進行慢病毒質粒轉染，稀釋到10個/mL；

將293T接種到6孔板（每孔接種2 mL），使其密度為40%。

待其生長到孔板面積80-90%進行轉染。

2、通過質粒大提獲得無內毒素質粒。

3、在1.5mLEP管中分別加入150μL DMEM培養基、15μL lipofectamine 2000。

4、在1.5 mL EP 管中分別加入700μL DMEM培養基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG（使三條質粒質量比為 4:3:1）。

5、將等體積的質粒混合物加入到轉染試劑混合物中，室溫靜置5min。

6、將隔夜培養的6孔板中培養基小心吸出，替換為新鮮DMEM（血清）細胞培養基。每個孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000復合物。

7、分別在轉染后24h、48h，收集六孔板中病毒上清液，經0.45μm的濾膜過濾或離心去除細胞碎片（短期內可放于4℃保存，長期保存于-80℃冰箱，勿反復凍融）。

B 慢病毒感染：

1、提前一周復蘇靶細胞，傳代三次以上保證細胞生長狀態良好。病毒感染前一天將靶細胞傳代到6孔板，使細胞生長密度為約20%。

2、待細胞生長至孔板面積50-60%時，加入2ml病毒液，加入polybrene,并補加0.5ml（血清）細胞培養基，恒溫培養24h。

3、用（血清）細胞培養基更換病毒液，恒溫培養24h。

4、加入適量的抗生素篩選，每次換液時補加抗生素，至靶細胞細胞無明顯死亡。

注意事項：

1.選擇合適的載體和元件：根據實驗需要選擇適當的質粒載體和啟動子，例如CMV啟動子、SV40啟動子等。

2. 細胞狀態和轉染密度：細胞狀態好，且處于指數生長階段。靶細胞密度不宜過高或過低，建議將細胞密度控制在指數期的70-80%；

3. 選擇合適轉染試劑、比例和轉染時間：選擇適當的轉染試劑，不同類型的細胞和外源DNA可能需要使用不同的試劑進行轉染；

同時，還需要對慢病毒質粒、DNA和轉染試劑的比例、轉染時間進行優化。可在感染靶細胞時加入適量的聚凝胺提高轉染效率。

4.抗生素濃度：可在轉染前做MTT實驗探究其工作濃度，選取合適的篩選濃度使轉染的細胞能夠存活并形成穩定的細胞系。

5.篩選時間：在進行穩定轉染實驗時，需要進行足夠長的篩選時間以檢測出穩定轉染的細胞系，轉染后可通過WB，流式細胞術，Dot blot等方法驗證。

6．對照組設置：設置陽性和陰性對照以評估轉染效果和篩選是否成功。

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