miRNA實驗解決方案（操作手冊）---第三章：miRNA 逆轉錄及實時熒光定量 PCR

一、miRNA 逆轉錄及實時熒光定量 PCR的概念
miRNA逆轉錄的概念
成熟miRNA的長度只有21~23nt，對miRNA進行qPCR定量時，無法直接對其進行正、反向引物的設計（通常正向引物就足以覆蓋miRNA全長），但是可以通過增加逆轉錄產物長度來解決這一問題，miRNA的逆轉錄方法有兩種，分別是莖環法和加尾法。

實時熒光定量PCR的概念
實時熒光定量PCR即Real-time PCR,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過Cr值和標準曲線對未知模版進行定量分析的方法。

二、miRNA逆轉錄及實時熒光定量PCR的原理

莖環法原理

莖環法miRNA逆轉錄最關鍵的一步就是設計莖環逆轉錄引物（由莖環結構和miRNA的3'末端六個反向互補的堿基組成），莖環逆轉錄引物首先與miRNA的3'末端結合，在逆轉錄酶的作用下進行反應，獲得人為加長的miRNA第一鏈cDNA。針對不同的miRNA，需要設計不同的莖環逆轉錄引物、配制不同的逆轉錄體系，因此莖環法miRNA逆轉錄具有特別高的特異性。

注：莖環逆轉錄引物中的莖環結構為固定已知序列，只需按照不同的miRNA序列3'末端的六個堿基，將其反向互補添加至莖環結構序列的3'端即可設計出特異性的莖環逆轉錄引物。

加尾法原理

增加miRNA逆轉錄產物長度最直接的方法就是增加miRNA的長度，加尾法首先通過Poly（A）聚合酶（PAP）向miRNA的3'末端添加Poly（A）尾，然后在逆轉錄酶的作用下，結合逆轉錄引物（由3'端帶有錨定堿基的Oligo dT序列和一段通用序列組成），即可獲得加長版的cDNA。加尾法逆轉錄可以對提取純化的所有miRNA進行無差別加尾，能夠同時逆轉樣本中多個miRNA，一次逆轉錄即可完成對所有qPCR模板的制備。

注：錨定堿基NV（V代表A、G或C，N代表ATGC中的任意一種）能夠特異性的結合到Poly（A）的5'端，以免逆轉出更多的T堿基，保證同一miRNA的逆轉錄產物大小相同；在Oligo dT序列的5'端存在一段可用于qPCR檢測的反向通用引物與cDNA的結合。


2、熒光定量PCR的化學原理

變產物DNA分子為熒光信號，通過測定熒光值即可反映產物DNA分子量，實時熒光定量PCR的化學方法有兩種，分別是SYBR®Green染料法和 TaqMan®Probe探針法。

SYBR®Green 染料法原理

一種DNA小溝非飽和性結合染料，與DNA結合時發光，不結合（游離）時不發光，每形成一條DNA雙鏈，就會有一定數量的染料結合上去，染料一結合，就會產生熒光信號，信號強度與DNA分子總數目成正比。

TaqMan®Probe探針法原理

一種水解探針（5'Reporter，3'Quencher），完整時不發光，水解后發光，每形成一條DNA鏈，就會水解一條探針，每水解一條探針，就會產生一個單位信號，信號強度與結合過探針的DNA分子總數目成正比。

注：探針要先于引物結合在模板上，因此Tm（探針）要比Tm（引物）大8～10℃。

SYBR®Green 染料法 VS TaqMan®Probe探針法原理

SYBR®Green 染料法：表達量比較高時推薦使用；

TaqMan®Probe 探針法原理：表達量比較低時推薦使用；

三、miRNA逆轉錄及實時熒光定量PCR的操作流程
1.莖環法miRNA逆轉錄反應
Vazyme 莖環法 miRNA cDNA 一鏈合成的專用試劑盒 ----------miRNA 1st Stand cDNA Synthesis kit（by stem-loop）(Vazyme #MR101)

Vazyme #MR101 產品優勢

1.優秀的線性關系：在寬廣的模版區間內具有良好的線性關系，可檢出低至pg級RNA模版。

2.優秀的反應體系：最適的Buffer組分及濃度，更適用于miRNA的逆轉錄。

3.簡便的引物設計：提供配套的引物設計軟件，使得引物設計更加簡便。

Vazyme #MR101實驗案例-----優秀的線性關系

以小鼠肝臟組織Total RNA的10倍稀釋梯度（10pg～1μg）為模板，使用miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit （by stem-loop） （Vazyme ＃MR101）進行逆轉錄，得到的cDNA使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）擴增mmu-miR-16基因。結果顯示， 在寬廣的模板區間內，該配套產品具有優異的線性關系。

·注意事項

1．防止RNase污染：保持實驗區域潔凈；操作時需穿戴干凈的手套、口罩；實驗所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。

2.5xgDNA Wiper Mix的使用：5xgDNA Wiper Mix含有高濃度的甘油，使用前請短暫離心收集到反應管底部，并用移液器輕輕吹打混勻。不應使槍頭插入液面過深，否則會因槍頭壁的粘附造成酶量的損失。

3．反應液的配制請在冰上操作完成。

·實驗流程

1．基因組DNA去除

a.在RNase-free 離心管中配制如下混合液：

用移液器輕輕吹打混勻。

b.按下列條件進行基因組DNA去除反應：42°C 2min。

2.第一鏈cDNA合成

a.在RNase-free離心管中配制如下混合液：

莖環引物推薦使用本公司miRNA Design軟件進行設計，此時，cDNA產物后續定量產品--miRNAUniversal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）中配套的逆向qPCR引物可直接使用，無需另外設計合成。
用移液器輕輕吹打混勻。

b.按下列條件進行第一鏈cDNA合成反應：

如果模版具有復雜二級結構或高GC區域，可將反應溫度提高至55°C，有助于提高產量。
產物可立即用于qPCR反應，短期保存建議存放-20°C；長期保存建議存放-70°C；cDNA應避免反復凍融。

2、加尾法miRNA逆轉錄反應

Vazyme 加尾法 miRNA逆轉錄是無法使用普通的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄的，因為其缺少Poly（A）聚合酶，無法添加Poly（A）尾。Vazyme為您提供加尾法miRNA合成cDNA的專用試劑盒-miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by tailing A）（Vazyme ＃MR201）。

·Vazyme ＃MR201 產品優勢

1．特別優秀的逆轉錄性能：逆轉錄效率高且熔解曲線單峰。

2．超高的逆轉錄特異性：專為miRNA逆轉錄定向改造的逆轉錄酶，搭配優化的緩沖體系，在保證高靈敏度的同時，最大限度降低 miRNA前體的逆轉錄。

3．簡便快捷的操作：加尾反應與逆轉錄反應一管進行，使得操作更加方便。

·Vazyme ＃MR201 實驗案例一一超高的逆轉錄特異性

以HeLa miRNA為模板（100ng／μl），分別使用專為miRNA逆轉錄定向改造的逆轉錄酶（Vazyme＃MR201）和未定向改造的逆轉錄酶（其余組分與Vazyme ＃MR201一致）進行逆轉錄反應，在相同條件下對逆轉錄反應得到的cDNA進行qPCR檢測2個體系?？梢钥吹剑褂?/span>Vazyme ＃MR201逆轉錄 miRNA后qPCR檢測得到的熔解曲線單峰且峰形優異，特異性更高。


注意事項
1.防止RNase污染：保持實驗區域潔凈；操作時需穿戴干凈的手套、口罩；實驗所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。

2.反應液的配制請在冰上操作完成。

實驗流程

1.在RNase-free離心管中配制如下混合液：

反應中使用的Total RNA必須含有miRNA。
用移液器輕輕吹打混勻。

2.按下列條件進行第一鏈cDNA合成反應：

反應得到的cDNA可立即或稀釋后用于熒光定量，對于高豐度表達的miRNA，可根據具體的Cr值，稀釋10~1000倍。
cDNA應避免反復凍融，短期保存建議存放-20°C；長期保存建議存放-70°C。

3、莖環法／加尾法miRNA實時熒光定量PCR

Vazyme 提供 SYBR Green I嵌合熒光法進行miRNA定量反應的專用預混液-miRNA Unimodal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ102），可同時兼容莖環和加尾逆轉產物。

Vazyme ＃MQ102 產品優勢

1.高效實驗：附贈U6內參上下游引物，配備莖環通用下游引物及相關設計軟件。

2.高靈敏度：可在pg級的總RNA中檢測目的miRNA。

3.強特異性：區分單堿基的差異，非特異識別率低于5%。

Vazyme #MQ102 實驗案例--高效實驗

Vazyme #MQ102配備了miRNA 莖環引物設計軟件和配套下游通用莖環引物，同時附贈人、大鼠、小鼠通用的U6內參上下游引物，可在寬廣的定量范圍內得到良好的標準曲線。

Vazyme #MQ102 實驗案例--高靈敏度：

以293T細胞RNA為模版稀釋6個梯度（1pg-100ng），用miRNA 1st Stand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)(Vazyme #MR101)進行反轉錄，獲得的cDNA用Vazyme

＃MQ102 檢測hsa-miR-21-5p基因表達情況。結果顯示，Vazyme ＃MQ102可在pg級的總RNA中檢測目的miRNA,且能在寬廣的定量范圍內得到良好的標準曲線。

Vazyme #MQ102 實驗案例--強特異性：

miRNA序列短，同一家族不同成員序列非常相似，有些僅有單個堿基差別，因此特異性對miRNA定量至關重要。Vazyme ＃MQ102核心酶以雙抗封閉，配以優化的Buffer，能夠區分單堿基的差異，非特異識別率低于5％，實現高特異性定量。

莖環定量引物設計

1、正向引物：建議根據完整miRNA序列除去3'末端6個堿基的剩余部分作為miRNA正向特異性引物，并將其中的U替換為T。也可使用本司提供的miRNA Design軟件設計，軟件和說明書請在【諾唯贊-資源支持-實驗工具】處下載。

2、反向引物：：莖環法的qPCR反向通用引物為莖環逆轉錄引物中莖環結構序列的一部分，所用莖環序列為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；本產品提供用于qPCR檢測的反向通用引物mQ Primer R，與本公司miRNA Design 軟件設計的逆轉錄引物配套，無需另外合成；當使用不同的莖環序列時，需自行設計合成qPCR下游引物。

加尾定量引物設計

1．正向引物：

①建議根據完整miRNA序列設計miRNA正向特異性引物，并將其中的U替換為T。

②若根據miRNA序列設計的正向特異性引物退火溫度過低，建議在引物5'端增加幾個堿基（以G和C為主），增加堿基后需驗證引物特異性，以免造成非特異性擴增；若引物退火溫度過高，建議刪去5'端幾個堿基。

③對于miRNA前體等長片段非特異性擴增，建議在正向特異性引物3'端增加1-3個A堿基。

④對于序列相似的miRNA，建議正向特異性引物3'端終止于差異堿基，若由于引物長度過短而導致退火溫度過低，可在引物5'端增加幾個堿基，使上下游引物Tm值匹配。反向

2.2、反向引物：本公司Vazyme ＃MR102中提供用于qPCR檢測的反向通用引物 Universalreverse Q primer，退火溫度約為66℃，無需另外合成；當使用不同的逆轉錄試劑時，需自行設計合成qPCR逆向引物。

·注意事項

1．本品盡量避免反復凍融，以免造成酶活下降。如每次使用量較少，推薦小份分裝使用。

2．使用前請上下顛倒以混勻Master Mix，請勿vortex避免產生氣泡，影響定量結果。MasterMix經混勻短暫離心后即可使用。

3．由于本品中含有熒光染料SYBR Green1，因此需避光保存，配制反應體系時應盡量避免強光照射。

4．由于本品檢測靈敏度特高，易被空氣中氣溶膠污染。因此反應體系配制時請于超凈工作臺內進行，配制過程中請使用滅菌槍頭、反應管，條件容許的實驗室推薦使用專用的移液槍和帶濾芯的槍頭。

5．本品中的藍色染料經測試不影響SYBR GreenI熒光的信號采集。

·實驗流程

1．在qPCR管中配制如下混合液

莖環法（相對定量內參體系配制參考右表）

加尾法（相對定量內參體系配制參考右表）

2.按下列條件進行qPCR反應：

miRNA逆轉錄及實時熒光定量PCR的常見FAQ
1.miRNA逆轉錄的常見FAQ

莖環法Vazyme＃MR101能否用于加Poly（A）尾法逆轉錄？

不能。MR101是通過莖環法逆轉miRNA，利用莖環引物在逆轉錄酶的作用下獲得cDNA。而加Poly（A）尾法體系中含有兩個酶的作用，首先是Poly（A）聚合酶在單鏈RNA的3'端加上一串Poly（A）尾，然后利用體系中的Oligo dT通用型引物在逆轉錄酶的作用下進行逆轉錄反應。MR101中沒有Poly（A）聚合酶，故不能用于Poly(A)尾法逆轉錄。

為什么莖環法Vazyme #MR101帶基因組清除組分，而加尾法Vazyme #MR201不帶基因組清除組分？
因為MR201中的Poly(A)聚合酶（PAP）不能對基因組DNA進行加尾，逆轉錄引物無法識別基因組DNA，所以MR201中不帶專門基因組清除的組分。

2、實時熒光定量PCR的常見FAQ

·miRNA推薦使用的內參：

small nucleolar RNA（snoRNA）長度約為60～300nt左右，在多種組織細胞中高表達，不涉及miRNA的調節途徑，所以snoRNA是很好的內參選擇。研究證實常用的snoRNAassays 包括：

Human:U6、RNU48、RNU44、U47;

Mouse:U6、snoRNA-202、snoRNA-234、snoRNA-420;

還有一類是在不同實驗條件下變化差異很小的miRNA：

Human/mouse tissues: miR-152、-186、-25、-92、-26b、-16;

Human/mouse cell lines: miR-374、-16、-93、-186、-26b;

還有一類是傳統沿用的18S rRNA or U6。

莖環法miRNA做逆轉、定量時，內參的逆轉錄引物和qPCR引物如何設計？以常用的U6內參為例，U6的序列足夠長，因此不需要設計莖環引物（當內參產物長度在80bp以上時就不需要設計莖環引物），U6在逆轉錄的時候投入qPCR下游引物即可，可以看作投入逆轉錄的特異性引物逆轉，后續qPCR定量的時候正常投入上下游引物即可。

加尾法miRNA做逆轉、定量時，內參的逆轉錄引物和qPCR引物如何設計？加尾法逆轉錄可以對提取純化的所有mRNA和miRNA進行無差別加尾，因此不需要對內參做單獨處理。

擴增曲線形狀異常？

1．擴增曲線不光滑：信號太弱，經系統矯正后產生，提高模板濃度重復實驗。

2．擴增曲線斷裂或下滑：模板濃度較高，基線的終點值大于C4值。減小基線終點（C1值-4），重新分析數據。

3．個別擴增曲線突然驟降：反應管內留有氣泡，處理樣本時要注意離心，進行擴增反應之前要仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留。

反應結束無擴增曲線出現？

1．反應循環數不夠：一般設置循環數為40，但需要注意的是過多的循環會增加過多的背景信號，降低數據可信度。

2．確認程序中是否設置了信號采集步驟：兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段；三步法擴增程序應當將信號采集設置在72℃延伸階段。

3．確認引物是否降解：長時間未用的引物應先通過PAGE電泳檢測完整性，以排除其降解的可能。

4．模板濃度太低：減少稀釋度重復實驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

5．模板降解：重新制備模板，重復實驗。

Cr值出現太晚？

1．擴增效率極低：優化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計合成引物。

2．模板濃度太低：減少稀釋度重復實驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

3．模板降解：重新制備模板，重復實驗。

4．體系中存在PCR抑制劑：一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗。

溶解曲線出現多峰？

1．引物設計不優：根據設計原則設計合成新的引物；莖環法可嘗試引物設計時向前延伸幾個堿基，增加引物特異性。

2．引物濃度太高：適當降低引物濃度。

3．cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板。

·陰性對照出現明顯擴增？

1．反應體系污染：更換新的Mix、ddH2O、引物重復實驗。反應體系在超凈工作臺內配制，減少氣溶膠污染。

2．引物二聚體的出現：配合熔解曲線進行分析。

實驗重復性差？

1．加樣體積失準：配制反應體系時盡量使用大體積移液配制，同時使用性能較好的移液槍和低吸附耗材。

2．定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準儀器。

3．模板濃度太低：模板濃度越低，重復性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。

·絕對定量時標準曲線線性關系不佳？

1．稀釋誤差：采用逐級稀釋法進行模板稀釋，配制反應體系時盡量使用大體積移液配制，同時使用性能較好的移液槍和低吸附耗。
2.系計算。

3．引物擴增效率差：根據設計原則設計合成新的引物。

4．標準品降解：重新制備標準品，重復實驗。

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