分子克隆實驗的流程及注意事項--二、TOPO克隆

時間：2025/3/18閱讀：518

二、TOPO克隆

引物設計與PCR擴增
1. 目的片段 PCR 擴增引物合成時，要求引物 5’端不可磷酸化修飾；

2. 建議使用高保真酶進行目的片段的 PCR 擴增，并摸索退火溫度，優化反應體系和程序。

PCR產物的純化回收
1.PCR 反應后，產物應當進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；

2.推薦使用切膠回收的方式純化 ( 切膠時間最好控制在 3min 內，避免紫外照射對 DNA 的損傷 )，回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測，濃度應當≥ 30ng/μl，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；

3.回收濃度低時，可通過增加 PCR 反應體系，采取多管反應單管回收的方式，提高回收產物的濃度。

目的片段連接至載體

1.連接反應體系按照說明書要求投入，各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過高可稀釋后使用；

2.連接反應溫度可嘗試 25°C或 37°C，時間 5min，若不長克隆或克隆空載體 / 假陽性，時間可嘗試延長至 30min；

3.連接反應建議在 PCR 儀中進行。

感受態轉化涂板

1.連接產物轉化的感受態細胞選擇使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學感受態細胞；

2.感受態細胞不可反復凍融使用，-80°C取出后建議一次用完；

3.重組產物體積與感受態細胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產物加入至 100μl 感受態細胞或 5μl 重組產物加入至 50μl 感受態細胞；

4.熱激時間：按照感受態細胞說明書操作進行；

5.平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉化的載體抗性需保持一致；

6.菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g，3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養基，保留100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。

單克隆菌落PCR鑒定

1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過大或過小的單克隆菌落；

2.挑取數個單克隆菌落進行鑒定分析；

3.挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后，吸取 1-2μl 作為PCR 反應（10/20μl 體系）模板；

4.推薦使用一對分別位于片段和載體的上下游引物進行 PCR 鑒定。

常見問題分析：

不長克隆

1. 片段類型錯誤：只兼容 PCR 擴增產物，且引物 5’端不可磷酸化修飾；
2. 片段投入不符合要求：片段應當切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系各組分投入體積不小于 1μl；片段投入量應按照說明書公式計算；
3. 連接反應不適當：反應應在 PCR 儀中進行，溫度可設置 25 或 37°C，連接時間可從 5min延長至 30min。

空載體 / 假陽性
1. PCR 擴增產物不單一：優化 PCR 體系，提高特異性；對目的片段切膠回收；鑒定更多單克隆；
2. 片段投入不符合要求：片段應當切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl；片段投入量應按照說明書公式計算；
3. 連接反應不適當：反應應在 PCR 儀中進行，溫度可設置 25 或 37°C，連接時間可從 5min延長至 30min；
4. 菌液 PCR 用酶不適合：PCR 酶活應當不受雜質影響，引物不應選擇插入片段 PCR 用引物進行檢測。

測序突變
1. 測序克隆數過少：測序單克隆數只有 1 個時，測序信息部分可信，建議多測幾個單克隆，檢查突變處的測序信號是否有問題，突變是否從模板引入；
2. 突變位置：若堿基突變位于引物處，建議重新合成引物再次實驗；位于其他部位的突變，應當使用高保真酶重新制備模板再次實驗。

測序片段不正確
1. PCR 擴增產物不單一：優化 PCR 體系，提高特異性；對目的片段切膠回收；鑒定更多單克隆；

2. 模板存在 Amp/kana 抗性的質粒：對目的片段進行切膠回收。

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