為何你的平板“空空如也”？感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化的這幾個小細節(jié)你注意到了嗎？

1.前言

在分子克隆實驗中，感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化是基因克隆的基礎(chǔ)步驟之一。但相信很多同學在涂板后，常常會出現(xiàn)平板上菌落稀少甚至“空空如也"的尷尬局面，這不僅耽誤我們的實驗進度，還會消耗寶貴的試劑和時間。實驗為何會卡在這一步？本篇文章，將從幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，一起和大家好好探討一下這個問題。

2.感受態(tài)細胞“不給力"

感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率直接決定了實驗成敗。如果細胞本身質(zhì)量不佳，后續(xù)操作再完好也無濟于事。例如感受態(tài)細胞經(jīng)常反復凍融或長期儲存（超過6個月），則很有可能會導致其活性顯著下降。

感受態(tài)細胞是非常脆弱的，一些操作上的失誤同樣會嚴重影響轉(zhuǎn)化效率，凍融過程中如果未將細胞置于冰上，則可能會破壞細胞膜的脆弱結(jié)構(gòu)；解凍后若未及時使用（如放置超過10分鐘），細胞活性會快速下降；加入質(zhì)粒后劇烈吹打也會破壞細胞膜，進一步降低轉(zhuǎn)化成功率。正確的操作應該是：凍融時需全程冰上操作，解凍后立即進行轉(zhuǎn)化反應，質(zhì)粒加入后僅需輕彈混勻。

3 質(zhì)粒“用量"不當或與宿主菌不兼容

質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化成功的核心，但它的用量常被忽視。在感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化實驗中，質(zhì)粒的用量需通過質(zhì)量（ng） 而非體積（μL）去控制。

若僅依賴體積添加，就可能會因為質(zhì)粒濃度差異導致實際用量超出合理范圍（通常建議是 50-100 ng），進而影響轉(zhuǎn)化效率。我們可以利用分光光度計測量質(zhì)粒濃度，再依照公式：體積（μL）= 目標質(zhì)量（ng） / 質(zhì)粒濃度（ng/μL），計算出所需添加的體積。

某些質(zhì)粒需要特定宿主菌才能正常復制或表達。例如pET系列質(zhì)粒需使用BL21(DE3)菌株表達蛋白，因為該菌株通過λ噬菌體DE3溶源整合，染色體攜帶T7 RNA聚合酶基因，可驅(qū)動pET質(zhì)粒的T7啟動子轉(zhuǎn)錄目標基因。若質(zhì)粒與宿主菌的復制起點不兼容不匹配，則可能導致質(zhì)粒無法復制，轉(zhuǎn)化后無菌落。

4 熱激條件不“精準"

熱激是感受態(tài)細胞吸收質(zhì)粒的關(guān)鍵步驟，其溫度、時間和操作順序需嚴格控制。若條件不精準，可能導致質(zhì)粒無法有效進入細胞或細胞膜修復過快，影響轉(zhuǎn)化效率。熱激時間過短，會導致無法充分打開細胞膜孔道；而熱激時間過長則可能損傷細胞。

熱激完后，我們還需要將細胞放在冰上冰浴一段時間，這一步的目的是修復細胞膜裂隙，避免細胞因膜結(jié)構(gòu)破損而死亡。如果少了這一步，就可能導致細胞膜無法閉合，轉(zhuǎn)化效率下降或細胞死亡。

5 抗生素“過量"或“失效"

抗生素是篩選成功轉(zhuǎn)化的抗性菌落的關(guān)鍵，但如果抗生素失效或濃度過高會直接導致轉(zhuǎn)化菌篩選失敗。儲存不當或過期的抗生素會失去抑菌活性，而濃度過高則會抑制目標菌生長。操作失誤，如使用添加錯誤類型抗性平板，也會導致實驗失敗。

6 涂板操作不“細致"

涂板是轉(zhuǎn)化的最后一步，一些操作上的細節(jié)疏漏也可能導致前功盡棄。涂布量過多或過少會影響菌落密度與生長效率，建議控制涂布量在10-50 μL。菌液未充分混勻或涂布器未覆蓋整個平板表面，導致局部菌落過密或空白。而如果使用涂布棒用力摩擦瓊脂表面，損傷細胞或菌液堆積。

正確的操作應該是：加入菌液后，使用無菌涂布棒輕柔旋轉(zhuǎn)，充分分散菌液；涂布后需靜置5分鐘，待菌液被平板全部吸收后再倒置培養(yǎng)，防止冷凝水滴落污染菌落。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經(jīng)科學等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務。可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時為客戶提供服務