細胞鋪板具體操作及流程

細胞鋪板是細胞實驗中的基礎(chǔ)操作，其目的是將細胞均勻分布在培養(yǎng)板上，以保證實驗結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。下面為你介紹詳細操作流程：

1.實驗準備

材料：細胞懸液、培養(yǎng)基、胰酶、PBS 緩沖液、血清、96 孔板或 24 孔板等培養(yǎng)板。

器材：移液器及配套槍頭、離心機、細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡。

試劑配制：提前配制好含 10% 血清的培養(yǎng)基，若細胞貼壁性差，還需用多聚賴氨酸對培養(yǎng)板進行包被處理，即將適量多聚賴氨酸溶液加入培養(yǎng)板各孔，室溫孵育 1-2 小時，吸去溶液，用 PBS 沖洗 2-3 次，晾干備用。

2.細胞懸液制備

取出細胞：從培養(yǎng)箱中取出長滿細胞的培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺內(nèi)，用移液器吸去瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基。

清洗細胞：向瓶內(nèi)加入適量 PBS 緩沖液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，潤洗細胞 1-2 次，以去除殘留培養(yǎng)基及雜質(zhì)，吸去 PBS。

消化細胞：加入適量胰酶溶液，覆蓋細胞層，將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞開始變圓、脫離瓶壁時，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。血清中的蛋白可中和胰酶活性，防止過度消化。

吹打細胞：用移液器反復(fù)輕柔吹打細胞層，使細胞全部分散成單細胞懸液。吹打過程要控制力度，避免產(chǎn)生過多氣泡損傷細胞。

離心收集：將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，以 1000-1500 轉(zhuǎn) / 分鐘的速度離心 3-5 分鐘，使細胞沉淀在管底。

重懸細胞：吸去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，用移液器輕柔吹打，將細胞重懸，制成均勻的細胞懸液。

3.細胞計數(shù)

稀釋細胞懸液：取少量細胞懸液，用培養(yǎng)基按 1:1 或 1:2 的比例稀釋，避免細胞濃度過高難以計數(shù)。

加載細胞懸液：將稀釋后的細胞懸液滴加在血細胞計數(shù)板的計數(shù)區(qū)，注意不要產(chǎn)生氣泡，蓋上蓋玻片。

計數(shù)細胞：在顯微鏡下，計數(shù)計數(shù)板四個大格內(nèi)的細胞總數(shù)。壓線細胞遵循 “計上不計下，計左不計右" 原則，避免重復(fù)計數(shù)。根據(jù)公式計算細胞濃度：細胞濃度（個 /mL）=（四個大格細胞總數(shù) / 4）× 稀釋倍數(shù) ×10^4 。

4.細胞鋪板

計算鋪板體積：根據(jù)實驗需求和培養(yǎng)板規(guī)格，確定每孔所需細胞數(shù)量。如 96 孔板每孔一般接種 5×10^3 - 2×10^4 個細胞，24 孔板每孔接種 5×10^4 - 2×10^5 個細胞。根據(jù)細胞濃度計算所需細胞懸液體積，如細胞濃度為 1×10^5 個 /mL，96 孔板每孔需接種 1×10^4 個細胞，則每孔需加入細胞懸液體積為 100μL。

鋪板操作：用移液器吸取計算好體積的細胞懸液，加入培養(yǎng)板相應(yīng)孔中。從培養(yǎng)板一側(cè)邊緣開始，逐孔加入，避免液體濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣過程中，若需接種多塊板，應(yīng)保持移液器操作一致，確保每孔細胞數(shù)量均勻。

輕柔混勻：加樣完成后，將培養(yǎng)板在水平桌面上輕輕晃動，或使用平板振蕩器，低速振蕩 1-2 分鐘，使細胞在孔內(nèi)均勻分布。注意振蕩幅度不宜過大，以免細胞聚集。

5.培養(yǎng)觀察

放入培養(yǎng)箱：將鋪好細胞的培養(yǎng)板放入 37℃、5% CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CO?可維持培養(yǎng)基 pH 值穩(wěn)定。

定期觀察：培養(yǎng) 2-4 小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及分布情況。若發(fā)現(xiàn)細胞分布不均，可輕微調(diào)整培養(yǎng)板位置，繼續(xù)培養(yǎng)。后續(xù)每天定時觀察細胞生長狀態(tài)，包括細胞形態(tài)、密度等，為后續(xù)實驗做準備。

細胞鋪板過程需嚴格遵守?zé)o菌操作原則，動作輕柔，確保細胞活性及分布均勻性，這樣才能保證實驗順利進行。

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