小分子蛋白如何跑WB?

在日常實驗過程中，小分子蛋白是非常常見的，常見的凋亡蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax，自噬相關(guān)蛋白如LC3B等均為小分子蛋白，接下來將從以下幾個方面分享小分子蛋白跑Wb時的注意事項：

1. 配膠：整體配膠遵循蛋白分子量越小膠濃度越大的原則，對于小分子蛋白來說，分離膠濃度一般為12%-15%，對于小分子蛋白條帶可以分的更加清晰。同時在倒膠時濃縮膠的比例可以適當增加到4：6，使其充分濃縮，后續(xù)電泳過程中一定程度上可以減少彌散。

2. 上樣：根據(jù)日常上樣經(jīng)驗，建議在跑小分子蛋白時增加1倍上樣量，防止蛋白彌散過多。選擇marker時，選擇適用于小分子蛋白的marker，后續(xù)敷抗體時可以更清楚的進行裁膜。電泳開始前可用1′loadingbuffer補齊未點樣的膠孔，防止兩邊不齊跑成“八"字。

3. 電泳：濃縮膠部分設(shè)置恒壓70V、30min左右，一般即可濃縮到一條線上之后調(diào)大電壓至110V，至所需蛋白區(qū)域全部分開為止。盡量避免長時間低電壓跑膠，易導(dǎo)致蛋白彌散過多。同時整個電泳過程中注意降溫。

4. 轉(zhuǎn)膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此轉(zhuǎn)膜時選擇0.22μm的PVDF膜，常規(guī)0.45μm膜容易穿透，剩余條件同正常蛋白一般可以滿足條件。

5. 封閉：快速封閉液或脫脂牛奶按正常條件封閉即可。裁膜時根據(jù)marker上下留出足夠多的空間。

6. 一抗孵育：在保證上述條件的基礎(chǔ)上，一抗是出好結(jié)果的關(guān)鍵一步，若沒前期實驗經(jīng)驗，一抗的稀釋比一般按照說明書配置，若有前期實驗的經(jīng)驗，可適當進行比例調(diào)整，一抗?jié)舛冗^高最后顯影階段易出現(xiàn)雜帶，過低則可能看不到條帶。使用1′TBST緩沖液稀釋，4℃孵育過夜。

7. 后續(xù)二抗比例及孵育時間、顯影按常規(guī)操作即可。需要注意若抗體不好用或者蛋白難出結(jié)果，在敷完一二抗時可適當延長洗膜時間及次數(shù)。

注意事項：

1. 轉(zhuǎn)膜時，若蛋白分子量過小，可適當提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。

2. 跑小分子蛋白時marker盡量不跑到一張膜上，對于常見內(nèi)參GAPDH、Actin及Tubulin等來說，分離膠濃度大上述蛋白區(qū)域一般分不開或分離不完整，易導(dǎo)致內(nèi)參不齊。

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