蛋白免疫檢測技術

時間：2025/5/20閱讀：208

蛋白免疫檢測技術是基于抗原與抗體特異性結合的原理，用于檢測生物樣品中蛋白質的存在、含量、分布及相互作用的一類分析技術。這類技術具有高特異性、高靈敏度等特點，廣泛應用于醫學診斷、生物學研究、藥物開發等領域。以下是幾種常見的蛋白免疫檢測技術及其原理、應用和特點：

一、酶聯免疫吸附測定（ELISA）

原理

將抗原或抗體固定在固相載體（如微孔板）表面，通過酶標記的抗原或抗體與待測樣品中的目標蛋白結合，加入底物后酶催化顯色反應，通過吸光度值定量分析目標蛋白。

類型

直接法：標記抗體直接結合抗原。
間接法：用未標記的一抗結合抗原，再用酶標記的二抗檢測一抗。
夾心法：用捕獲抗體固定抗原，再用酶標記的檢測抗體結合抗原，適用于雙表位抗原的定量。
競爭法：待測抗原與標記抗原競爭結合抗體，用于小分子抗原檢測。

應用

醫學診斷：檢測病原體抗體（如 HIV、乙肝病毒）、腫瘤標志物（如 CEA）。
科研：細胞因子、激素等微量蛋白的定量分析。

點

靈敏度高（pg-ng 級）、操作簡便、可高通量檢測。

缺點

可能存在非特異性結合，需設置嚴格對照；僅能檢測可溶性蛋白。

二、免疫印跡法（Western Blot，WB）

原理

電泳分離：通過 SDS-PAGE 電泳按分子量分離蛋白樣品。
轉膜：將蛋白轉移到固相膜（如 PVDF 膜、硝酸纖維素膜）上。
免疫反應：用一抗和酶 / 熒光標記的二抗結合目標蛋白，通過化學發光或顯色劑顯影。

應用

驗證蛋白表達（定性或半定量），分析蛋白分子量及修飾（如磷酸化、糖基化）。
檢測細胞或組織中的特異性蛋白（如癌癥相關蛋白）。

優點

特異性強，可同時分析蛋白表達和分子量。

缺點

操作步驟繁瑣，耗時較長；定量準確性低于 ELISA。

三、免疫熒光技術（Immunofluorescence，IF）

原理

用熒光素（如 FITC、Alexa Fluor）標記抗體，與細胞或組織中的目標蛋白結合，通過熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察熒光信號，定位蛋白在細胞內的分布（如細胞膜、細胞質、細胞核）。

類型

直接免疫熒光：標記一抗直接結合抗原。
間接免疫熒光：未標記一抗結合抗原，再用熒光標記的二抗檢測，信號更放大。

應用

細胞生物學：研究蛋白亞細胞定位、動態變化（如細胞骨架蛋白、受體分布）。
自身抗體檢測：如抗核抗體（ANA）的熒光顯微鏡診斷。

優點

直觀顯示蛋白空間分布，可實現多色標記（同時檢測多種蛋白）。

缺點

需熒光顯微鏡，樣品制備要求高；熒光信號可能隨時間衰減。

四、免疫組織化學技術（Immunohistochemistry，IHC）

原理

將組織樣本制成切片（如石蠟切片、冰凍切片），用抗體檢測組織中目標蛋白的定位和表達水平，通過酶顯色（如 DAB 顯色呈棕黃色）或熒光標記顯示結果。

應用

病理診斷：鑒別腫瘤類型（如乳腺癌 ER/PR 檢測）、判斷預后（如 Ki-67 增殖指數）。
研究組織中蛋白的分布特征（如炎癥因子在組織中的表達）。

優點

保留組織形態學結構，便于結合病理特征分析。

缺點

結果判讀依賴經驗，定量準確性較低。

五、免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

原理

用抗體特異性結合目標蛋白，通過 Protein A/G 磁珠或瓊脂糖珠捕獲抗原 - 抗體復合物，分離純化目標蛋白，用于后續分析（如 WB、質譜）。

應用

研究蛋白 - 蛋白相互作用（如免疫共沉淀 Co-IP）。
富集低豐度蛋白，用于結構或功能研究。

優點

高效分離目標蛋白，適用于復合物分析。

缺點

需高親和力抗體，操作需優化避免非特異性結合。

六、流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）

原理

用熒光標記抗體標記單細胞懸液中的目標蛋白，通過流式細胞儀檢測細胞表面或胞內蛋白的表達水平，同時分析細胞群體的物理特性（如大小、粒度）。

應用

免疫學：免疫細胞分型（如 T 細胞亞群 CD4+/CD8 + 檢測）。
癌癥研究：細胞周期、凋亡相關蛋白分析。

優點

可高通量分析單細胞水平的蛋白表達，兼具定量和細胞分型功能。

缺點

需流式細胞儀，樣品需制備成單細胞懸液。

七、化學發光免疫分析（CLIA）

原理

以化學發光劑（如魯米諾、吖啶酯）標記抗體，抗原 - 抗體反應后，通過化學反應釋放光子，用 luminometer 檢測光信號強度，實現定量分析。

應用

臨床檢測：激素（如甲狀腺激素）、腫瘤標志物的高靈敏度定量。

優點

靈敏度高于 ELISA（fg 級），自動化程度高，適合大規模檢測。

技術發展趨勢

多重檢測：如流式細胞術、多色免疫熒光可同時檢測多種蛋白。
自動化與高通量：ELISA、CLIA 的全自動檢測平臺提高效率。
高分辨率成像：超分辨率顯微鏡結合免疫熒光技術，解析蛋白納米級分布。
單細胞技術：單細胞免疫熒光、流式細胞術實現單細胞水平異質性分析。

這些技術各有側重，實際應用中需根據檢測目的（定性 / 定量 / 定位）、樣品類型（細胞 / 組織 / 體液）及靈敏度要求選擇合適的方法，或結合多種技術進行綜合分析。

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