(一) 準備工作
1.在開始工作以前，要清除生物安全柜內表面的污染。
2.將所有必需的物品置于安全柜內，以盡可能減少雙臂進出前面開口的次數。物品放置要注意以下幾點：
①II級生物安全柜臺面前面和后面的進氣格柵不能被物品阻擋。
②所有物品應盡可能地放在工作臺后部靠近工作臺邊緣的位置，并使其在操作中不會阻擋后部格柵。
③可產生氣溶膠的設備(如：混勻器、離心機等)應靠近安全柜的后部放置。有生物危害性的廢棄物袋、盛放廢棄吸管的盤子等體積較大的物品，應該放在安全柜內的某一側。
④潔凈的物品應放置在距離產生氣溶膠器皿至少15 cm外，降低交叉污染的可能性。
⑤容易受紫外線損傷的實驗樣本可以在紫外線殺菌后的實驗之前放入。
⑥不要在工作區內排放過多的物品。
3.關閉操作前窗，打開生物安全柜的紫外燈，對生物安全柜工作臺面，側壁表面以及后壁內側進行殺菌處理。
4.稍微打開操作前窗，讓生物安全柜工作區排氣幾分鐘之后再開始工作。


(二) 操作注意事項
1.在使用生物安全柜時應穿著個體防護服并戴手套防止被污染。在進行一級和二級生物安全水平的操作時，可穿著普通實驗服。手套應套在實驗服袖口外面。有些操作可能還需要戴口罩和護目鏡。
2.在生物安全柜內，避免使用酒精燈等明火滅菌器。使用明火會對氣流產生影響，并且在處理揮發性物品和易燃物品時，也易造成危險。在對接種環進行滅菌時，可以使用紅外線電加熱器,或者干脆使用一次性塑料接種環。
3.手和雙臂伸入到生物安全柜中等待大約1min,以便安全柜調整完畢并且讓里面的空氣“掃過"手和雙臂的表面以后，才可以開始對物品進行處理。
4.工作時，盡量減少手臂的移動，移動時要緩慢，防止干擾柜內氣流。在移動雙臂進出安全柜時，需要小心維持前面開口處氣流的完整性，雙臂應該與工作區開口垂直地緩慢進出前面的開口。
5.在工作臺面上的實驗操作應該按照從清潔區到污染區的方向進行，所有操作在工作臺面的中后部進行。
6.工作時，耐高壓滅菌的生物危害性廢棄物袋以及吸管盛放盤放在安全柜內不能拿出安全柜，否則在使用這些物品時雙臂就頻繁進出安全柜，這樣會干擾安全柜空氣屏障的完整性，從而影響對人員和物品的防護。
7.一旦實驗過程中產生溢灑物，用消毒紙巾置于其表面吸附清理。
8.盡量使安全柜處于持續工作狀態，并對所有物品進行表面消毒處理，提供大程度的人員保護。從安全柜內部拿取可能產生污染的物品時，要進行表面消毒處理。