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基因與細胞治療領域的病毒載體生產用細胞株的開發

時間：2022-5-26 閱讀：774

基因治療被認為是許多嚴重的和危及生命的疾病有效的治療手段，得到越來越多人的關注。同時，基因治療的適應癥正從罕見/極罕見疾病向更常見疾病發生轉變，患者數量和綜合療法越來越多。因而，大規模的基因治療病毒載體生產是行業的迫切需求。

2020年，FDA更新了關于基因治療臨床試驗申請(INDs)的化學、制造和控制指導原則，內容包含穩轉細胞株開發及細胞克隆性確證等。文件指出，細胞庫（Cell bank）的穩定性及純度是一個需要考慮的重要方面。非單克隆來源的細胞群中，其細胞異質性相對較高，產量低的細胞系往往與高產細胞群體競爭，導致高產細胞個體占比越來越少，最終隨著傳代次數的增加，導致細胞庫或工作庫的質量下降，因此，通過單克隆細胞篩選是提高病毒載體產量及質量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細胞種群降低其異質性的方法，通過防止異種細胞群體的產生，來保障未來生產出的病毒產品的質量不受影響。

CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）針對 ELEVECTA® AAV包裝細胞系的研究數據顯示，通過單克隆篩選出的細胞株其AAV產量要比非單克隆細胞來源的高10倍左右。

張瑰宜博士在“生物藥生產用細胞株構建和篩選策略”研討會上分享了她們使用Cytena 的單細胞打印機SCP的感受，其噴墨式打印技術溫和而高效的分選單細胞，簡化篩選工作流程，大大提高了單克隆有效率，獲得了穩定性高及一致性好的單克隆，用于后續的AAV生產，大大的提高了AAV產量。

克隆HEK293細胞的記錄

HEK293單克隆細胞提高AAV產量

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生物藥生產用細胞株構建和篩選策略

英國著名的葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）藥物研究中心報告了一種如何快速獲得穩轉的293T細胞，生成慢病毒載體的方法：將編碼所有慢病毒載體成分的單個 DNA 結構體穩轉入293T細胞，單細胞打印機進行單克隆篩選，獲取遺傳學和功能穩定的適應懸浮培養的生產用293細胞系。由此產生的懸浮細胞系可生產出與瞬時轉染一樣高滴度的病毒，可以在一次性攪拌罐生物反應器中輕松放大，并且在后續細胞培養中遺傳和功能穩定。此方法將降低慢病毒載體的大規模生產成本，提升慢病毒載體在細胞治療中的應用價值。（Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.）

在基因編輯領域，Stephan Riesenberg等學者進行細胞克隆基因型和靶基因拷貝數分析時使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供體電穿孔在 FRMD7 基因中編輯 409-B2 hiPSC，分別用（不用）2 M M3814 處理細胞 3 天后使用單細胞打印機(Cytena)對細胞進行單克隆化用于后續分析。文章中HEK293 和 K562 細胞的單克隆化也是通過使用單細胞打印機分選單細胞來獲得的。（Stephan R , Manjusha C , Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.）

Gross等采用f.sight™單細胞打印機，通過GFP報告基因，用于選擇和克隆CRISPR/Cas9編輯以敲除RANKL蛋白的間充質干細胞(MSC)，以進一步增強MSCs在再生醫學中的治療能力。

分割線

參考資料

[1] 提升高產細胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開發——單細胞打印機（附案例分享）

[2] 簡化CRISPR基因編輯的干細胞的工作流程，提高單克隆效率

艾貝泰作為Cytena中國代理，公眾號（Applitech）中多個軟文詳細介紹Cytena單細胞打印機篩選原理、功能更新、應用文獻以及案例分享等，掃碼關注公眾號，不間斷更新關于Cytena單細胞打印機以及其他代理品牌信息。

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