Nat Immunol | 研究人員發現調控NK細胞殺傷靶細胞的新機制

近年來，腫瘤免疫療法已廣泛應用于癌癥的臨床治療中，各種類型的免疫細胞特別是那些可以通過細胞間接觸溶解靶細胞的免疫細胞受到了研究人員的重點關注。其中，由于自然殺傷細胞（NK）具有非特異性直接殺傷腫瘤細胞的特性，被認為是人體抵抗癌細胞和病毒感染的第一道防線。許多研究表明，免疫突觸（IS）的形成是NK細胞清除靶細胞的關鍵，它們可以識別和消除病毒感染和轉化的癌細胞。盡管對IS的特征及其形成過程有了深入了解，但通過細胞骨架調節其穩定性的機制尚不清楚。

近期，韓國生物科學與生物技術研究院免疫治療研究中心的研究團隊在著名期刊《Nature immunology》發表了題為“NgR1 is an NK cell inhibitory receptor that destabilizes the immunological synapse"的文章，他們報道了一種新型的NK細胞抑制性受體Nogo受體1（NgR1），它通過干擾接觸穩定性和調節IS形成來影響NK細胞對表達NogoA靶細胞的殺傷能力，并確定NgR1為IS形成過程中的免疫檢查點，提出了一個可用于改善腫瘤免疫治療的潛在靶點。

為了驗證NgR1干擾NK細胞的抗腫瘤功能，該團隊首先研究了NgR1在細胞表面的表達，結果顯示NgR1在多種免疫細胞中均有表達，如小鼠原代NK細胞、CD8 T細胞和EL4細胞系（圖1a），而NgR1的配體NogoA在各種癌細胞系中表達。隨后，對NgR1是否參與免疫細胞的細胞溶解過程進行了研究，發現在NEP1-40（NgR1的拮抗肽）處理后，NgR1敲除小鼠（KO）的脾細胞比WT小鼠的脾細胞具有更高的細胞溶解能力（圖2c），并驗證了NEP1-40的特異性（圖1d）。接下來，通過建立WT和KO小鼠肺轉移小鼠同基因模型（圖1e），進一步證明了NK細胞中的NgR1對腫瘤生長具有負調控作用。此外，為了研究NgR1缺陷導致的抗腫瘤效果的改善是否源于免疫成分的內在變化，對WT和KO小鼠的免疫細胞群進行了分析（圖1h）。結果表明，NgR1缺陷并不影響免疫細胞的組成，提示NgR1主要參與NK細胞的效應功能。

圖1 NgR1缺陷增強了NK細胞殺傷能力

在小鼠中，NgR1參與了NK細胞的腫瘤控制，因而在人類NK細胞中也可能具有重要的作用。作者發現，NgR1及其輔助受體在人體UCB-NK、PB-NK、MNK、NK92和Jurkat細胞系中都有表達（圖2a）。為研究NgR1的信號轉導機制，使用Nogo-P4（NgR1激動肽）在NK細胞中激活了NgR1，發現在NK92細胞和UCB-NK細胞中，RhoA和LIMK都被激活，而Cofilin失活（圖2b）。RhoA的激活通過肌動球蛋白的收縮和粘連蛋白的失活來促進應力纖維的形成，導致肌動蛋白細胞骨架重組。且F-肌動蛋白的積聚會引起細胞膜突起的形成，從而影響細胞的遷移和黏附。通過在表達Lifeact-GFP的NK92細胞中直接顯示F-肌動蛋白，并使用視頻顯微鏡觀察Nogo-P4處理對F-肌動蛋白動態變化的影響。結果表明，經過Nogo-p4處理的NK92細胞中F-肌動蛋白強度和膜突出頻率都顯著增強（圖2c、d、e）。這些數據表明，NK細胞中的NgR1通過RhoA信號調節肌動蛋白細胞骨架。

圖2 NgR1促進NK細胞F-肌動蛋白聚合

隨后，為了評估NgR1在NK細胞殺傷中的特異性，作者通過調節NK細胞或靶細胞中NgR1的表達來探究NK細胞介導的細胞殺傷作用。在幾乎不表達NogoA的腫瘤細胞中，使用或不使用NEP1-40阻斷NgR1對NK的殺傷效果沒有差異（圖3a）。而在過表達NogoA的K562腫瘤細胞中，NK介導的殺傷效果降低，并可以被NEP1-40所挽救（圖3b、c）。在用NEP1-40處理后，NK細胞對U87MG細胞的細胞毒性增強（U87MG細胞是一種已知高表達NogoA35的腦瘤細胞系）（圖3d）。并且當抑制U87MG細胞中NogoA的表達或NK92細胞中NgR1的表達時，同樣會增強NK細胞毒性（圖3e、f）。因此，上述結果表明，在NogoA存在的情況下，NgR1對NK細胞的細胞溶解功能具有抑制作用。

值得一提的是，為了在K562細胞中過表達NogoA和在NK92細胞中抑制NgR1的表達，研究人員使用了NEPA GENE公司的NEPA21高效基因轉染系統分別對上述細胞進行電穿孔，并成功將pCMV-NogoA質粒和NgR1 siRNA導入至相應細胞中，實現基因過表達和敲降的目的。

圖3 NK細胞介導的殺傷作用以NogoA-NgR1依賴性方式被抑制

接下來，作者通過活細胞成像系統觀察了NK細胞與靶細胞之間的相互作用，以探究NgR1如何抑制NK細胞介導的細胞殺傷。結果表明，大多數對照NK92細胞與U87MG細胞只有瞬時相互作用，而NEP1-40處理的NK92細胞與U87MG細胞穩定接觸，且部分NK92細胞最終殺死U87MG細胞（圖4a）。通常情況下，NK細胞與靶細胞先產生瞬時相互作用，然后形成穩定突觸，再引導裂解細胞顆粒的極化分泌進行靶細胞裂解（圖4b）。研究發現，NEP1-40處理顯著減少了瞬時相互作用，增加了接觸時間，從而增強了細胞毒性（圖4c-e）。這表明，NgR1信號通過干擾穩定的突觸形成來降低NK細胞的殺傷作用。

在后續實驗中，該團隊還通過一系列實驗深入探究了NgR1信號調節NK細胞與靶細胞接觸的分子機制，證明了NK細胞與靶細胞的接觸是由NgR1信號通路介導的F-肌動蛋白動態變化實現的，NgR1能促進F-肌動蛋白從細胞間接觸向外聚合，導致NK92細胞在細胞顆粒向IS極化之前脫離。最后，他們使用異種移植小鼠模型對NgR1阻斷劑的治療效果進行了初步研究，證明了NgR1在免疫細胞中的表達可以作為免疫檢查點抑制IS的形成，并認為NgR1可能是腫瘤控制中一個新的治療靶點。總之，作者通過嚴謹的實驗設計和巨大的工作量證明了NgR1是一種新型的NK細胞抑制性受體，它通過LIMK-cofilin介導的肌動蛋白動態變化來抑制穩定IS的形成，進而調控NK細胞對腫瘤細胞的殺傷力，揭示了NgR1改善NK細胞功能的一種潛在機制。

在本研究的轉染實驗中，該團隊多次借助NEPA21電轉染儀將質粒和siRNA成功導入至腫瘤細胞或NK細胞中，這顯現出NEPA21在難轉染細胞中具有良好的轉染效果，可以為科研人員在NK細胞的研究中提供強大助力。

NEPA21高效基因轉染系統采用全新設計的電轉程序，配合電壓衰減設計，在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率。操作簡單，電轉參數可見可調，適用性強。特別適用于難轉染的原代免疫細胞、干細胞、神經細胞、活體動物、受精卵及宮內胚胎等的轉染，已應用于眾多著名期刊文獻中，是進行懸浮/貼壁細胞、活體和離體組織轉染的電轉系統主流品牌之一。

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