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白酒風味研究 | 同位素標記輔助LC/Q-TOF全景分析大曲中羰基化合物
白酒風味、品質研究正成為行業熱點。影響白酒品質的因素有多種，其中發酵是關鍵因素。大曲作為白酒釀造過程的發酵劑，不僅為白酒釀造提供微生物，還提供風味物質及其前體，因此，大曲的品質與白酒品質密切相關。羰基化合物是大曲的風味物質之一，其對大曲的品質影響很大。高覆蓋分析大曲中的羰基化合物，不僅有助于評價大曲的品質，而且可以指導高品質白酒生產。但羰基化合物具有結構多樣、質譜信號響應低等特點，需要高靈敏、高分辨質譜技術實現高覆蓋檢測。
為了滿足行業前沿需求，中國科學院大連化學物理研究所許國旺研究團隊與茅臺集團微生物研究團隊合作，在 Journal of Chromatography A 發表題為“Profiling and annotation of carbonyl compounds in Baijiu Daqu by chlorine isotope labeling-assisted ultrahigh-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry”的研究論文，提出了一種基于氯同位素標記輔助結合超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜（UHPLC-Q/TOF MS）高覆蓋篩選和深度注釋白酒大曲中羰基化合物的策略。采用該策略，在醬香型白酒大曲中檢測和注釋了 487 種羰基化合物，其中 341 個得到準確鑒定或推測鑒定。這是迄今為止大曲中羰基化合物數目最多的報道。在準確鑒定的化合物中，有 5 種從未在白酒和大曲中報導過。
該研究建立的方法具有高效、經濟、簡便等優點，為復雜生物樣品中羰基化合物的全景分析提供了一種新策略。
羰基化合物的整體注釋策略
白酒大曲中羰基化合物的注釋策略流程如下（圖 1）：
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首先，利用 Agilent 6546 Q-TOF 液質聯用系統，對 2-肼基-4-氯吡啶（HP-Cl）標記后的樣品全掃描分析，依據 Cl 元素的天然同位素特征及保留時間的一致性，提取出潛在羰基化合物。
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其次，對潛在羰基化合物進行靶向 MS/MS 分析。
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最后基于化合物的 tR、MS1、MS/MS 和特征碎片，將提取出來的潛在羰基化合物注釋為 6 個等級，用于對鑒定結果的綜合判斷。
圖 1. 醬香型白酒大曲中羰基化合物的注釋策略
本策略無需重同位素標記試劑，利用氯的天然同位素特征來篩選衍生化的羰基化合物，同時結合 MS1、預測保留時間（tR）、in silico MS/MS 和人工注釋碎片等多維信息，實現復雜生物樣本中羰基化合物的深度注釋。
醬香白酒大曲中羰基化合物的高覆蓋鑒定
采用上述方法，對醬香型白酒大曲中的羰基化合物進行了全面表征和鑒定。以 5- 羥甲基糠醛為例具體示意整個鑒定流程（圖 2）。
圖 2. 醬香型大曲中 5-羥甲基糠醛的鑒定過程：（A）大曲中 5-羥甲基糠醛的MS1同位素峰，（B）大曲中 5-羥甲基糠醛的 MS/MS（C）三個候選結構的tR，（D）tR = 4.58 min and m/z = 252.0539 待測峰的結構注釋，（E）大曲和標樣的 5-羥甲基糠醛 EIC 對比圖，（F）大曲和標樣的 5- 羥甲基糠醛 MS/MS 對比圖
本研究在醬香型白酒大曲中共檢出 487 種羰基化合物，其中 341 個得到準確鑒定或推測鑒定，對比已有文獻，這是迄今為止大曲中羰基化合物數目最多的報道。此外，在準確鑒定的化合物中，有 5 種羰基化合物從未在在白酒和大曲中報導過。
不同生態位和不同季節大曲的差異分析
文章進一步結合統計學分析，采用主成分分析（PCA）、火山圖等，對不同生態位（黃、白、黑曲）和不同季節（春、夏、秋）生產的大曲羰基化合物進行了差異研究，發現：白、黃、黑曲中羰基化合物存在顯著性差異（圖 3）；夏、春、秋季大曲中的羰基化合物差異也很大（圖 4）。這可能與制曲初期，黑色大曲的溫度最高，白色大曲的溫度最低，加上夏季溫度高于春季溫度和秋季溫度，導致發酵溫度影響羰基化合物在大曲中的分布，且發酵溫度越高，產生的羰基化合物就越多的緣故。
圖 3. 比較不同顏色夏季大曲中的羰基化合物：（A）PCA 得分圖，（B）黑色大曲 vs 白色大曲的火山圖，（C）黃色大曲 vs 白色大曲的火山圖
圖 4. 春、夏、秋黑大曲中羰基化合物的二維主成分分析得分圖（A）、夏季大曲與春季大曲中羰基化合物的火山圖（B）、夏季大曲與秋季大曲中羰基化合物的火山圖（C）
為了研究造成不同大曲之間羰基化合物顯著差異的原因，本研究還將羰基化合物與大曲的酸度、糖化能力、還原糖含量、水分和淀粉含量等理化參數進行了相關性分析（圖 5）。夏季不同顏色大曲中的羰基化合物主要與大曲的酸度呈正相關，而與糖化力呈負相關。不同季節黑色大曲中的羰基化合物主要與大曲的酸度、還原糖含量和水分相關。且大曲的酸度、還原糖含量與大曲中的羰基化合物呈正相關，而大曲的水分與大曲中的羰基化合物呈負相關。可見，大曲的糖化力、酸度、還原糖含量和水分對大曲中的羰基化合物有很大的影響。因此，在大曲的制作過程中，調整這些參數將會影響大曲中的羰基化合物的產生，進而影響大曲的品質和白酒品質。
圖 5. 理化指標與不同顏色大曲中羰基化合物變化的相關性研究（A）、大曲不同季節理化指標與羰基化合物變化的相關性研究（B）
本研究開發了一種基于氯同位素標記、超高效液相色譜-高分辨質譜聯用（CIL-UHPLC-Q/TOF MS）技術，對白酒大曲中羰基化合物進行高覆蓋率、高靈敏分析的策略，結合數據挖掘算法和統計分析，為揭示不同種類大曲羰基化合物代謝特征提供技術支撐，對大曲質量評估和白酒風味、品質研究具有重要意義。
專家介紹
許國旺
中國科學院大連化學物理研究所研究員
中國科學院大連化學物理研究所生物技術部常務副主任，中國科學院分離分析化學重點實驗室主任，代謝組學研究中心主任。2004 年獲國家自然科學基金委杰出青年基金資助。現任中國化學會色譜專業委員會主任、中國抗癌協會腫瘤代謝委員會副主任、中國生物工程學會系統生物醫學專業委員會副主任、中國化學會理事等。
正在擔任 TrAC-Trends Anal Chem 的特約編輯, Metabolites 的副主編及 Anal Chem（2021-2022）, Anal Chim Acta，J Proteome Res 等 10 多個雜志編委。國際 HPLC 會議科學委員會常委。
已在 PNAS, Nat Protoc, Nat Commun, Hepatology, Adv Sci, Diabetes Care, Cancer Res, Clin Chem, Anal Chem 等國際著名雜志發表多篇高水平文章。連續 4 次入選“全球 100 名最有影響分析科學家”，連續 7 年入選愛思唯爾“中國高被引學者”榜單。申請發明專利超百件（其中 90 多項已授權）。
課題組主要研究方向：復雜樣品分離分析方法的創新性研究；代謝組學、暴露組學分析技術平臺及其在疾病、中藥、植物表型、食品安全等方面的應用研究。
參考文獻：
https://doi.org/10.1016/j.chroma.2023.464110