皖儀科技液相色譜

測定醬油中黃曲霉毒素·柱后碘試劑衍生專機系統

繼前期文章《應用案例 | 皖儀科技液相色譜測定黃曲霉毒素》（點擊藍色標題閱讀原文）采用了光化學衍生器檢測了中藥材中黃曲霉毒素中B族和G族化合物。本篇文章參考了《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》GB 5009.22-2016第三法高效液相色譜-柱后碘試劑衍生方法條件，采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置熒光檢測器、柱后衍生系統進行檢測。

1 實驗方法

1.1 儀器配置

       皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列

1.2 測試條件

液相色譜條件流動相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）；

等梯度洗脫條件：A，61%；B：39%；

色譜柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱溫：40℃；

流速：1.0 mL/min；

進樣量：50μL；

柱后衍生系統衍生溶液：0.05%碘溶液；

衍生溶液流速：0.2mL/min；

衍生反應管溫度：70℃；激光波長：360nm；發射波長：440nm。

1.3 試劑及實驗材料

甲醇（CH3OH）：色譜純；

乙腈（CH3CN）：色譜純；

氯化鈉（NaCl）；

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）；

磷酸二氫鉀（KH2PO4）；

氯化鉀（KCl）；

鹽酸（HCl）；

吐溫-20（C58H114O26)；

碘衍生使用試劑：碘（I2）；

混合標準溶液（AFT B1和AFT G1：1μg/mL，AFT B2和AFT G2：0.3μg/mL）；

免疫親和柱；

一次性注射器；

微孔濾膜（0.22μm、0.45μm）；

渦旋混合器；

超聲波清洗機；

離心機：轉速≥6000 r/min；

氮吹儀。

1.4 溶液配制

n  1.4.1乙腈-甲醇溶液（50＋50）

取500mL乙腈加入500mL甲醇。

n  1.4.2磷酸鹽緩沖溶液（PBS）

稱取8.00g氯化鈉、2.92g十二水磷酸氫二鈉、0.20g磷酸二氫鉀、0.20g氯化鉀，用900mL水溶解，用鹽酸調節pH至7.4，用水定容至1000mL。

n  1.4.3 1%吐溫-20的PBS

取10mL 吐溫-20,用PBS定容至1000mL。

n  1.4.4 0.05%碘溶液

稱取0.1g碘，用20mL甲醇溶解，加水定容至200mL，用0.45μm的濾膜過濾，現配現用。

n  1.4.5混合標準工作液（AFT B1和AFT G1：100ng/mL，AFT B2和AFT G2：30ng/mL）

準確移取混合標準溶液（AFT B1和AFT G1：1μg/mL，AFT B2和AFT G2：0.3μg/mL）1mL，用乙腈稀釋并定容至10mL。密封后避光-20℃下保存，三個月內有效。

n  1.4.6標準系列工作溶液

分別準確移取混合標準工作液10μL、50μL、200μL、500μL、1000μL、2000μL、4000μL至10mL容量瓶中，用初始流動相定容至刻度（含AFT B1和AFT G1濃度為0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL，AFT B2和AFT G2濃度為0.03ng/mL、0.15ng/mL、0.6ng/mL、1.5ng/mL、3.0ng/mL、6.0ng/mL、12ng/mL的系列標準溶液。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

       圖1 黃曲霉毒素G2標準曲線及相關系數 

       圖2 黃曲霉毒素G1標準曲線及相關系數

      圖3 黃曲霉毒素B2標準曲線及相關系數

                圖4 黃曲霉毒素B1標準曲線及相關系數

說明：黃曲霉素素G2、G1、B2與B1標準曲線線性范圍較好，線性相關系數＞0.9999，滿足實驗分析需求。

2.2 標準品

      圖5 黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1標準品色譜圖

      表2黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1標準品色譜參數表

說明：由上述混標譜圖可見，標準品分離較好，分離度在2.0以上，滿足分離要求。

2.3 重復性

    圖6 黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1標準品重復性實驗色譜圖

            表3黃曲霉毒素G2色譜參數

            表4黃曲霉毒素G1色譜參數

            表5黃曲霉毒素B2色譜參數

                               表6黃曲霉毒素B1色譜參數

說明：黃曲霉毒素G2保留時間RSD值為0.116%，峰面積RSD值為0.620%；黃曲霉毒素G1保留時間RSD值為0.104%，峰面積RSD值為0.575%；黃曲霉毒素B2保留時間RSD值為0.100%，峰面積RSD值為0.259%；黃曲霉毒素B1保留時間RSD值為0.114%，峰面積RSD值為0.346%，重復性較好。

2.4 檢出限

       圖7黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1標準品色譜圖

         表7黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1色譜參數

          表8黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1檢測限

2.5 樣品測試

n  2.5.1樣品提取

稱取5.0039g醬油于50mL離心管中，加入甲醇定容至25mL,渦旋混勻，置于超聲波中振蕩20min，在6000 r/min下離心10 min,取上清液備用。

n  2.5.2樣品凈化

2.5.2.1上樣液的準備準確移取4mL上述上清液，加入46mL 1% 吐溫-20的PBS，混勻。2.5.2.2免疫親和柱的準備將低溫下保存的免疫親和柱恢復至室溫。

n  2.5.2.3試樣的凈化

免疫親和柱內的液體放棄后，將上述樣液移至50mL注射筒中，調節下滴速度，控制樣液以1mL/min～3mL/min的速度穩定下滴。待樣液滴完后，往注射筒內加入2×10mL水，以穩定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，在親和柱下部放置10mL刻度試管，取下50mL的注射器筒，2×1mL甲醇洗脫親和柱，控制1mL/min～3mL/min的速度下滴，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮氣緩緩將洗脫液吹至近干，用初始流動相定容至1.0mL，渦旋30s溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中進樣。進樣量取50μL上樣分析，檢測譜圖如下：

                                  圖8醬油樣品色譜圖

說明：從檢測結果可知，醬油樣品中未檢出黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1，結果正常。

3 結論

本次采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置熒光檢測器、柱后衍生系統，依據《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》GB 5009.22-2016第三法高效液相色譜-柱后衍生法。實驗結果顯示，黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1的線性良好，R值均在0.999以上，各黃曲霉毒素峰型較好，分離度均在2.0以上，分離效果好。黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1的定性RSD（%）和定量RSD（%）均小于1%，符合標準。說明了該方法配備皖儀科技LC3200系列儀器檢測黃曲霉毒素的可行性，完全滿足黃曲霉毒素的檢測要求。