細胞復蘇、傳代與凍存操作流程
儀器 | 試劑 | 耗材 |
離心機 | 胎牛血清（FBS） | 離心管（15ml、50ml） |
生物安全柜 | 無菌 1×PBS pH=7.2 | T-25 細胞培養瓶 |
電動移液器 | 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA | 一次性無菌移液管（2ml、5ml、10ml） |
CO2 培養箱 | wan全培養基（含血清） | 1.8mL 凍存管 |
倒置顯微鏡 | 凍存液：90%FBS+10%DMSO | 程序降溫盒 |
恒溫水浴鍋 | ||
超低溫冰箱 |
復蘇
1）將恒溫水浴鍋中的水預熱到 37℃；
2
）準備一支 15ml 離心管，加入 5ml 含 10%FBS 的wan全培養基，放入 37℃水浴鍋中預熱；
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）戴上護目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復蘇的細胞，盡快轉入 37℃恒溫水浴鍋中復溫晃動凍存管以提高復溫速率；
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）將融化了的凍存管中的細胞吸入事先準中，混勻后，1000rpm 離心 5min； 5 6
注意：從液氮中取出細胞凍存管時，若凍存管內有液氮進入，需擰松凍存管，排出內部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。
傳代
（細胞傳代建議一傳二）
1.
當細胞匯合度達到 85%以上時，可進行傳代。
2.
在生物安全柜內，打開培養瓶瓶口，收集瓶內的培養基；
3.
向培養瓶內加入 3ml 無菌的 1×PBS 后，水平放置培養瓶，使 PBS 能夠浸潤到培養瓶底面上所有的面積，吸棄 PBS； 4. 5. 7. 8. 9.
注：如還有部分細胞未消化下來，可采用分步消化：
① 準備一個無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的wan全培養基；
② 將消化下來的細胞吸入①中的離心管內中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養瓶中加入 1ml 胰酶繼續消化 2min 左右，輕拍培養瓶，95%左右細胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的wan全培養基中和，中和后的細胞懸液移入①中的離心管內。
6.1000rpm 離心 5min；
凍存
（細胞凍存建議每瓶 T25 凍一支）
1~6
）參照傳代步驟
7）離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細胞沉淀，然后轉入 1.8ml 凍存管中；
8）將凍存管轉入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉入-80℃冰箱中過夜降溫；
9）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉入液氮罐中保存。
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