熒光成像 失敗原因與成功訣竅

要點1：確認使用的物鏡是否合適

要進行顯微鏡觀察必須了解觀察目的與物鏡特性是否相符。尤其在熒光觀察中重要的是數值孔徑（NA），數值孔徑越大，越能獲取明亮，正常情況下，數值孔徑越大分辨率也越高，可獲取精細的圖像，但在另一方面，景深（Depth of Field：DOF）則變淺，被攝物體的可視對焦范圍變窄。除此以外，物鏡亮度或觀察距離也需要考慮，這些特性間的相關關系如下圖所示。

另外還有需要蓋板玻璃校正^*1及校正環調整^*2的物鏡、專用于特殊觀察方法的光學設計物鏡等各種各具特點的物鏡^*3。根據觀察方法選擇合適的物鏡尤為重要。

*1 蓋板玻璃校正：
蓋板玻璃校正物鏡設有蓋板玻璃校正值。正常情況下，蓋板玻璃使用0.17 mm，塑料培養皿為1.2 mm，不使用蓋板玻璃時使用0 mm物鏡。

*2 校正環調整：
高倍率物鏡中還有外殼部分帶有校正環（類似表盤）的部件。根據蓋板玻璃的厚度調整校正環，分辨率可變化數倍，使用前請務必確認校正環的狀態。

*3 物鏡的特點：
按照觀察方法，有時需要符合觀察方法的特定光學設計物鏡。包括相差、微分干涉、偏光、熒光、油鏡等。請確認物鏡種類。

要點2：從低倍率向高倍率調整物鏡

要點3：由近及遠查找焦點位置

要點1：使用適合觀察的相機

相機也有很多種類，下面介紹廣泛用于熒光顯微鏡的CCD相機的特點。
熒光觀察中重要的是S/N比（信號與干擾的比率）足夠高，因此在下表中合適的是黑白制冷CCD相機。

*1 可見光：
一般是指波長大約為400至700 nm的光。彩色相機的顯示與人眼相同，會切斷波長長度700 nm以上的光。因此無法觀察。

*2 暗電流和制冷：
CCD相機內部在沒有輸入光的狀態下也會產生叫作“暗電流"的信號，是造成干擾的原因。曝光時間越長受光元件的溫度越高，干擾也變大，通過冷卻相機可抑制干擾。

要點2：使用調節亮度功能

亮度調節功能有多種，在相機設定中主要的調節方式是以下3個項目。理解這些特點并熟練地區分使用對熒光成像非常重要。

• 曝光時間

• 快門處于開啟的時間。為在此期間積蓄信號，曝光時間越長亮度越高，同時暗電流干擾也會累積從而干擾增多。

• 增益

• 對輸入CCD元件的電信號進行電性放大。但是，放大輸入信號后，干擾也會同時被放大。分辨率不因增益值而變化。

• Binning（像素融合）

• 將臨近的像素視為1個假想像素，提高每個單位像素的接收信號量的功能。由于像素被合并圖片整體的像素數減少，分辨率將下降，但不會增加干擾。

要點3：熒光濾光片與試劑的匹配

即使熒光信號明亮而發光，如果濾光片透過率過低，仍無法充分觀察信號。重要的是盡量使用透過率高的濾光片。
熒光濾光片由激發濾光片與吸收濾光片、二向色鏡共3部分組成。確認激發濾光片是否與試劑的激發光譜重疊，吸收濾光片是否與試劑的熒光光譜重疊。假設加入濾光片上標注470/40時，表示可涵蓋470nm±20nm的波長范圍。數值數據難以理解時，觀察試劑與濾光片的光譜數據來判斷是否匹配。各種試劑或濾光片的光譜數據可通過各廠商的網站等確認。

要點4：物鏡的選擇

熒光信號偏弱，或對比度不足時，可通過更換NA值更大的物鏡，以便更明亮地觀察。 NA值越大，越能夠明亮地觀察熒光信號。物鏡的倍率越高，NA值也趨于變大，S/N比的上升不夠理想時，通過使用倍率更高的物鏡也可解決問題。

要點5：光源的選擇

有些光源沒有發出要觀察的波長。需要確認使用的光源，了解光源的特點并區分使用。
相比于水銀燈或金鹵燈是1種光源包含短波長到長波長的大范圍波長，激光或LED是1種光源只發出特定范圍的波長，因此需要將多個光源組合使用。信號無法順利發光時，確認試劑與光源波長的光譜數據。

要點1：激發光強度下降

降低激發光強度，熒光就會相應地變暗，因此需要提高相機增益或延長曝光時間。但是，提高增益或延長曝光時間，就會增大暗電流的干擾，S/N比變低。
要在抑制淬滅及損傷的同時拍攝S/N比高的圖像，需要盡量使用靈敏度高的相機。

要點2：縮短激發光照射時間

要縮短激發光照射時間，需要降低基本的操作時間，因此盡量縮短對焦時間、信號查找所用的時間、設定曝光時間所用的時間等操作所用的時間。
另外，對于手動控制激發光快門開閉的顯微鏡類型，可能發生忘記關快門而造成長時間持續照射激發光，導致淬滅。因此拍攝結束后或臨時停止觀察時，及時關閉快門尤為重要。