使用熒光顯微成像系統(tǒng)的鈣成像

鈣成像分析

近年來(lái)，使用熒光顯微鏡進(jìn)行鈣成像（Ca成像）拍攝的研究者正在不斷增加。
鈣成像是一種測(cè)量鈣在細(xì)胞內(nèi)的流動(dòng)情況，對(duì)活動(dòng)中的神經(jīng)元鈣信號(hào)進(jìn)行直接觀察的方法。被廣泛運(yùn)用在腦細(xì)胞研究等領(lǐng)域。

大家都知道，對(duì)生活在陸地上的脊椎動(dòng)物而言，鈣是一種非常重要的成分。在用于攝食各類(lèi)動(dòng)植物的堅(jiān)固牙齒中，鈣也是很重要的構(gòu)成物質(zhì)。還與激素及神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、肌肉的收縮、神經(jīng)細(xì)胞的可塑性變化等，生物體內(nèi)的眾多生命現(xiàn)象息息相關(guān)。利用鈣成像技術(shù)，觀察在生物體內(nèi)活動(dòng)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，可以對(duì)有鈣離子參與的細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)行詳細(xì)的觀測(cè)。

鈣成像的原理

進(jìn)行鈣成像時(shí)，需要借助熒光顯微鏡或熒光平板分析儀進(jìn)行觀察。將一旦與鈣離子結(jié)合，就會(huì)改變熒光強(qiáng)度的蛋白質(zhì)或鈣熒光指示劑導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化，檢測(cè)鈣離子的濃度變化。
但是，由于鈣熒光指示劑的熒光效果非常微弱，觀察時(shí)必須輔以大功率的激光照射，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，在絕大多數(shù)人眼中，順利完成鈣成像并非易事。

鈣成像的失敗事例及對(duì)策

鈣成像的失敗事例，其實(shí)類(lèi)似于熒光顯微鏡活細(xì)胞成像的失敗事例，細(xì)胞衰弱、焦點(diǎn)模糊、細(xì)胞逃離視野，這些都屬于常見(jiàn)的失敗事例。

例如，如果對(duì)鈣成像開(kāi)始一段時(shí)間后的細(xì)胞狀況進(jìn)行觀察，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰弱甚至死亡的現(xiàn)象。
其中的重要原因之一，就是高強(qiáng)度的激發(fā)光對(duì)細(xì)胞造成了損傷（光毒性）。
解決這一問(wèn)題的對(duì)策如下所示。

• 請(qǐng)盡可能使用靈敏度高的相機(jī)

• 請(qǐng)并用增益或Binning

• 請(qǐng)采用能夠感知微弱熒光的設(shè)定

• 請(qǐng)盡量調(diào)弱激發(fā)光

• 不進(jìn)行拍攝時(shí)請(qǐng)切斷激發(fā)光

在進(jìn)行鈣成像的過(guò)程中，有時(shí)還會(huì)發(fā)生焦點(diǎn)從中途就模糊的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)闇囟绕茖?dǎo)致細(xì)胞移動(dòng)，設(shè)定出錯(cuò)，抑或是細(xì)胞在分裂過(guò)程中上下移動(dòng)，致使焦點(diǎn)偏移。許多實(shí)施熒光顯微鏡觀察的研究者都經(jīng)歷過(guò)這樣的情況。
作為對(duì)策，可以使用自動(dòng)對(duì)焦功能或Z棧功能，預(yù)防焦點(diǎn)偏移的發(fā)生。

鈣成像的觀察事例

什么是G CaMP？

一種由蛋白質(zhì)構(gòu)成的鈣傳感器。
運(yùn)用基因工程技術(shù)，用綠色熒光蛋白、鈣調(diào)素、肌球蛋白輕鏈片段拼接而成的鈣傳感器蛋白質(zhì)?？梢灾踩牖?，使之與動(dòng)物模型的組織、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子結(jié)合，起到僅對(duì)目標(biāo)組織或細(xì)胞瘤實(shí)施鈣成像處理的目的。