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植物的自身熒光模糊的去除

閱讀：395 發布時間：2024-11-12

農學
何謂自身熒光
基于自身熒光的植物觀察的課題與對策
獲取沒有熒光模糊的清晰圖像的方法

何謂自身熒光

自身熒光的原理

自身熒光（autofluorescence）是指，由細胞結構或特性等產生的自然放光（光致發光：PL）。向物質照射激發光時，由于吸收光（光子）的能量，電子處于激發狀態。從此狀態返回基底狀態時發出的光就是光致發光原理。細胞內的線粒體或溶酶體等細胞器（細胞小器官）、膠原蛋白或彈性蛋白等細胞外基質、NADH或核黃素等黃酮類的環狀化合物具有可發出熒光的構造，由此表現出自身熒光。在植物細胞中，表現出自身熒光的典型物質有葉綠素（與光合作用相關的葉綠體）或細胞壁內木質素等。

自身熒光的波長

一般情況下，自身熒光被350至500 nm波長的光激發，并發出350至550 nm的短波長光。
例如，發出自身熒光的典型環狀化合物NADH被340 nm左右的波長激發，并發出460 nm波長為主的藍色自身熒光。另一方面，在植物的光合作用中利用吸收的光發揮激發能量作用的葉綠素，發出680 nm波長為主的自身熒光。
掌握不同物質的激發光波長及其響應性、自身熒光波長，對清晰地觀察目標物質或組織尤為重要。

基于自身熒光的植物觀察的課題與對策

植物熒光觀察的課題

在觀察植物等多細胞生物時，一般利用熒光蛋白質選擇性地標示目標細胞或結構，并通過放大細胞或結構來進行詳細觀察。但是，在植物熒光觀察中，若作為觀察目標的細胞或蛋白質的信號微弱時，自身熒光會干擾識別，尤其在觀察植物細胞時，葉綠素等發出自身熒光的物質是造成熒光模糊的典型因素。
植物的自身熒光導致的熒光模糊使目標物質的觀察更加困難，因此如何實施熒光模糊對策，從而獲取易于觀察、分析的清晰圖像就成為了課題。

自身熒光導致的熒光模糊對策

例如在植物細胞觀察中，防止葉綠素的自身熒光造成妨礙的對策一般采用濾光片。
如上所述，葉綠素的自身熒光以680 nm為峰值的狹小范圍波長發出。使用符合該波長區域的熒光濾光片套件，排除680 nm左右的波長后進行觀察，從而在抑制熒光模糊等自身熒光影響的情況下進行熒光觀察。
另外，在無法確定引起熒光模糊的自身熒光波長，或不具有固有波長特性時，采取首先通過標準熒光濾光片組件嘗試各種波長，以找出可排除自身熒光的波長，然后使用該濾光片讓目標物質更易于觀察的方法。

植物觀察的課題與要求

利用濾光片去除自身熒光產生的熒光模糊的方法，在確定可排除自身熒光的波長及與其對應的濾光片上需要花費時間與精力。此外，在觀察植物細胞的內部結構時，需解剖器官，或將組織切成薄片制作切片標本。制作這些標本需要具備高超的技術和經驗。同時在制作標本時，有可能對植物施加機械力而發生意外反應。
而且，通過組織切片等二維圖像難以分析、評價實際的三維結構。因此，如何利用熒光模糊少而清晰的圖像選擇性觀察目標細胞或組織，進而準確高效地觀察三維結構，成為植物研究上的重大課題，也是重要的需求。

獲取沒有熒光模糊的清晰圖像的方法

全新熒光顯微成像系統能夠簡單快速地獲取沒有熒光模糊的清晰圖像，進而滿足實現三維觀察等的各種課題或要求。下面使用實際的植物（土豆）觀察圖像，介紹植物觀察課題的解決案例及其方法。

消除自身熒光模糊的清晰全幅對焦圖像

基恩士的一體化熒光顯微成像系統BZ-X800在不使用激光的情況下憑借光學手法消除自身熒光導致熒光模糊的“光學切片"功能，輕松獲取清晰圖像。
光學切片是指，通過使用“光學切片算法"*消除熒光模糊，從而只保留調焦點位置上鮮明的熒光，由此簡單快速地獲取清晰圖像的功能。并且，通過使用光學切片功能的同時在Z軸方向拍攝多張圖像，在標本的縱深方向上的各種高度不受熒光模糊的影響，僅獲取準確的熒光信號。只從拍攝的多個圖像中檢測并合成焦點對準的部分，可構建焦點對準整體的全幅對焦圖像。由此，可以省去從濾光片套件中尋找要消除波長的對應濾光片的時間與精力，得以立即觀察清晰圖像。