腺病毒包裝實驗

重組腺病毒載體是基于人腺病毒 5 型（Ad5），其基因組是 36kb 長的線性雙鏈 DNA，是一種復制缺陷型腺病毒載體系統。具有以下幾個顯著優點：感染范圍廣，幾乎可以感染所有的細胞系、原代細胞和部分組織；感染效率可高達 100%；對外源基因容載能力大（可以高達 8Kb）；不整合基因組；滴度高，操作方便。因此，重組腺病毒是一種最ju有潛力的基因遞送工具。

最chang用的腺病毒包裝體系有 AdEasy 和 AdMAX 兩種，其共同特點是目的基因首先克隆到穿梭載體，再重組到腺病毒的大骨架上。以上兩個系統均具有腺病毒早期轉錄復制基因 E1 和 E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3），其中 E3 基因對病毒的產生并非必需。因此，腺病毒包裝必需依賴表達 E1 的細胞系，例如 HEK-293，HEK-293A 等。

一、實驗流程

圖 1、 腺病毒包裝實驗流程圖

二、實驗儀器與材料

表 1、腺病毒包裝系統質粒

三、實驗步驟 

1. 質粒構建和擴增

AdMAX 系統：構建連接目的基因的 pHBAdMAX質粒和pBHGlox(delta)E1, 3Cre 質粒并大量抽提，用于轉染 293A 細胞。

AdEasy 系統：構建連接目的基因的 pHBAdEasy 質粒并進行酶切線性化；線性化后轉入 BJ5183 感受態（含 pAdEasy-1 骨架質粒）進行重組，涂板培養單克隆并擴增，抽提質粒進行 PacI 酶切驗證；驗證正確的重組質粒轉化 Stbl3 感受態，得到高純度的重組質粒并進行 PacI 酶切線性化，用于轉染 293A 細胞。

2. 腺病毒包裝

表 2、腺病毒包裝轉染體系

3. 腺病毒收集

挑取 3-6 個空斑不等，放入1 ml新鮮培養基中過夜，然后比較滴度，使用滴度最高的一個空斑進行后續實驗。（注：病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成。為了限制病毒的擴散而讓空斑更好地形成，可在培養液中加入低熔點瓊脂糖，一般在轉染后第 10 ~ 21 天可以在顯微鏡下看到小的空斑。）

4. 腺病毒擴增

將培養基中的病毒加入新鮮 293A 細胞培養液中進行病毒少量擴增，至再次出現空斑，收集細胞及上清，反復凍融三次收集病毒（P1 代），感染 293A 細胞，連續進行三代感染，至 P4 代進行腺病毒的大量擴增并收集病毒。

5. 腺病毒純化

將病毒從 -80 ℃ 冰箱取出，室溫水浴融化。在 4 ℃ 下，7000 g 離心 10 min，棄細胞碎片，收集上清，0.22 μm 過濾除菌即可用于細胞實驗。若用于對腺病毒滴度和純度要求高的動物實驗，則需要采用 PEG8000 沉淀-CsCl 密度梯度離心-透析聯用法進行純化。

6. 病毒重懸和保存

棄上清，500 μl 重懸液重懸病毒沉淀，一周內使用則置于 4 ℃ 保存，如需長時間存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。

四、注意事項

1. 腺病毒相關實驗請在生物安全柜（BL-2 級別）內操作。

2. 操作病毒時請穿實驗服，佩戴口罩和手套，盡量不要裸露雙手及手臂的皮膚。

3. 操作病毒時特別小心病毒濺出。如果操作時超凈工作臺有bing毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培養板、培養液請用84消毒液浸泡后統一處理。

4. 如需要離心，應使用密封性好的離心管，如有必要請用封口膜封口后離心。

5. 動物注射操作請在生物安全柜內（BL-2 級別）完成。

6. 病毒相關的廢棄物需要特殊收集，統一經高溫滅菌處理。

7. 實驗完畢用洗手液清洗雙手。

五、常見問題

1. 腺病毒載體有幾代，需要怎樣選擇？

第一代腺病毒載體：E1/E3 基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體；

第二代腺病毒載體：E2A/E4 基因缺失的腺病毒載體被稱為第二代腺病毒載體，產生的免疫原性較低，載體容量和安全性方面均提高，但病毒包裝難度和出毒滴度嚴重下降，應用受限。

第三代腺病毒載體：第三代載體缺失了全部的或大部分腺病毒基因，僅保留了兩端 ITR 和包裝信號。包裝容量高達 35kb，免疫原性極低，載體中引入核基質附著區基因用于外源基因長期表達并增加了載體的穩定性。但第三代載體系統需要腺病毒突變體作為輔助病毒。

目前，第一代腺病毒載體仍是科研和臨床應用最為廣泛的腺病毒載體，因此更為推薦。

2. 腺病毒的兩種包裝系統怎么選擇？

需要根據自己實驗室的經驗以及需求進行選擇。

（1）AdEasy 系統：操作步驟相對可控，AdEasy 系統得到的病毒滴度相對較高。AdEasy 系統是較常用的系統，在 BJ5183 感受態中完成環狀腺病毒基因組的重組，將重組腺病毒基因組經 Pac I 酶切線性化后轉染 293A 細胞。但重組腺病毒基因組的陽性率比較低，需要挑選大量的克隆進行驗證。

（2）AdMax 系統：是直接將穿梭質粒和骨架質粒導入到包裝細胞 293A 中，重組過程不可控，中間無法進行篩選，所以重組假陽性較高，篩選陽性結果的難度較 AdEasy 系統高很多。 但 AdMax 包裝系統流程更簡便易操作，適合新手研究人員。

3. 腺病毒純化的目的是什么？

純化后的腺病毒可以去除缺損的病毒顆粒、細胞毒素、細胞培養基、以及細胞碎片等雜質。純化腺病毒免疫原性較低，更適合做動物實驗。

4. 腺病毒感染毒斑和細胞聚集怎么進行區分？

鏡下觀察發現類似病毒空斑或者細胞聚集的現象時，應繼續培養 1-3 天，觀察聚集區域是否擴散，若持續擴散一般為病毒毒斑，若聚集區域保持不變，則一般為細胞聚集現象。

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