了解或者做過Western Blot的同學(xué)都應(yīng)該清楚，經(jīng)過電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需經(jīng)過“轉(zhuǎn)膜"步驟，將蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上進(jìn)行固定后，才能進(jìn)行后續(xù)各種方法的Western Blot的檢測。Western Blot中膜的選擇是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中一般可以選擇硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜，PVDF膜結(jié)合能力強(qiáng)且具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，可以重復(fù)使用。那么你知道該如何使用PVDF膜嗎？讓我們一起來看看吧！

一、何為PVDF膜？如何選擇PVDF膜?

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。大于20KDa的蛋白選用0.45μm的膜，小于20KDa的蛋白選用0.2μm的膜。

二、PVDF膜使用時要用甲醇浸泡嗎？

PVDF膜在使用時需要進(jìn)行預(yù)處理，用甲醇處理的目的就是活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合。PVDF膜本質(zhì)是一種疏水性的聚合物，在水溶液中不會浸濕。為了在水性緩沖液和系統(tǒng)中使用PVDF膜，首先必須將其浸泡在50%(v/v)或更高濃度的醇溶液中。甲醇、乙醇和異丙醇都適合浸泡這種膜。

三、如何確定PVDF膜轉(zhuǎn)膜成功

可以采用染色法來確定轉(zhuǎn)膜是否成功，PVDF膜染料分2類，可逆染料和不可逆染料。

可逆染料在評估印跡之后可被從膜上洗掉。這些操作不干擾后續(xù)的免疫檢測或印跡上蛋白的其它分析。zui常用的可逆蛋白染料是麗春紅。可逆染料的主要缺點(diǎn)在于它們的靈敏度低于不可逆染料，但是在大部分情況下并不影響使用。

不可逆染料通常表現(xiàn)出最佳的靈敏度，但會干擾或阻止蛋白的進(jìn)一步分析。不可逆染料有氨基黑和考馬斯亮藍(lán)等。

四、PVDF膜的保存

在WB曝光結(jié)束后仍需要保存膜以便后續(xù)使用，膜的保存條件是由與膜結(jié)合的蛋白的穩(wěn)定性決定的。盡管PVDF是一種化學(xué)耐受性好的聚合物，有著出色的長期穩(wěn)定性。但是我們還是建議低溫保存，當(dāng)然室溫對于一些蛋白也是可以的。PVDF膜在4℃下最多保存2周，-20℃下最多2個月，-70℃下可以長期保存。

注意：保存在冰箱冷凍室的印跡膜不能受到機(jī)械沖擊，這會導(dǎo)致膜破損。印跡膜應(yīng)恢復(fù)到室溫后才從塑料袋中取出。印跡膜也可放在塑料袋中置于4℃，但應(yīng)加入疊氮化na等殺菌劑，以防止細(xì)菌生長。在使用之前必須徹di洗掉疊氮化物，以免抑制HRP的活性。

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