原代細胞培養、傳代、凍存、復蘇、分離、鑒定

原代細胞培養技術


一、組織塊直接培養法

1、取材，用 Hank's 液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
2、用手術剪將組織剪切成 1 mm³ 左右的小塊，再用 Hank's 液洗三次。
3、將組織塊轉移至培養瓶，并貼附于瓶底面。
4、輕輕將培養瓶翻轉，瓶底朝上，向瓶內注入適量的培養液，將培養瓶放置在 37 ℃ 恒溫箱內培養。
5、放置待組織小塊貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，使組織浸入培養液中（勿使組織漂起），37 ℃ 繼續培養。

二、消化培養法

1、取材，用 Hank's 液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
2、用手術剪將組織剪切成 1 mm³ 左右的小塊，再用 Hank's 液洗三次。
3、視組織塊量加入酶液，37 ℃ 中消化 20～40 分鐘，每隔 5 分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
4、加入 3～5 mL 培養液以終止酶消化作用（或加入相關酶抑制劑）。
5、靜置 5～10 分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
6、1,000 rpm，離心 10 分鐘，棄上清液。
7、加入 Hank's 液 5 mL，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
8、加入培養液 1～2 mL（視細胞量），血球計數板計數。
9、將細胞轉移到培養瓶中，37 ℃ 下培養。

三、 器官培養

1、將不銹網做成支架形狀，調整其高度至培養皿的 1/2 深度平面，在其表面放置 0.5 μm 孔徑濾膜。
2、將培養液加入培養皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。
3、將要培養器官組織放在濾膜上，一般厚度不要超過 200 μm，水平面積不超過 10 mm²。
4、將上述準備好的培養物放入 CO₂ 培養箱，并加注氧氣調整氧分壓，最好到 90%。
5、培養過程中要注意觀察培養液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。
6、上述可進行器官培養 1～3 周，每 2～3 天換液一次，并根據情況做進一步實驗和檢測。
 

原代細胞傳代技術


一、貼壁細胞的消化法傳代

1、吸除或倒掉瓶內舊培養液。
2、加入 1 mL 左右消化液（胰蛋白酶或與 EDTA 混合液）輕輕搖動培養瓶，使瓶底細胞都浸入溶液中。
3、消化 2～5 分鐘后把培養瓶放置在顯微鏡下進行觀察，發現原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時，棄去消化液，加入培養液終止消化。
4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分別接種到另外兩到三個培養瓶中，置 37 ℃ 培養箱中繼續培養。第二天觀察貼壁生長情況。

二、懸浮細胞的傳代

1、直接傳代
① 讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉 1/2～2/3。
② 用吸管吹打形成細胞懸液后，分別接種到另外兩到三個培養瓶中，置 37 ℃ 培養箱中培養。

2、離心法傳代
① 將細胞連同培養液一并轉移到離心管內，離心 800-1,000 rpm，5 分鐘。
② 去除上清，加新的培養液到離心管內，用吸管吹打使之形成細胞懸液。
③ 將細胞懸液分別接種到另外兩到三個培養瓶中，置 37 ℃ 培養箱中培養。

 

原代細胞凍存技術


1、選用生長情況好，數量較多的原代細胞，凍存前一天換液一次。
2、貼壁細胞需用 0.25% 胰酶常規消化將細胞消化下來，將細胞懸液收集至離心管中。
3、1,000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清液。
4、沉淀加含 DMSO 的培養液，計數，調整至（1-10）×10⁶/mL。
5、將懸液分至凍存管中，每管 1 mL。
6、密封凍存管，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。
7、用記號筆標明細胞種類，凍存日期。
8、按下列順序降溫：室溫→4 ℃（20 分鐘〕→冰箱冷凍室（30 分鐘）→超低溫冰箱（-80 ℃ 過夜）→液氮。

 

原代細胞復蘇技術


1、取出細胞，迅速放入 37 ℃ 溫水中快速解凍。
2、吸出細胞懸液，并加 10 倍以上培養液。
3、1,000 r/分鐘離心 5 分鐘，去除上清。
4、用培養液適當稀釋后接種培養瓶，放入 37 ℃ CO₂ 培養箱靜置培養。
5、鏡檢細胞貼壁能力。次日更換一次培養液，繼續培養。

 

原代細胞鑒定技術


一、形態學鑒定

1、在倒置顯微鏡中直接觀察活細胞的形態學特征
2、細胞染色檢查 ：
a) 將無菌玻片置于細胞培養皿中，加細胞懸液后培養；
b) 待細胞長滿玻片后取出，用 PBS 清洗，之后放于載玻片上，待其自然干燥；
c) 用 PBS/甲醇（1:1）固定 15 分鐘；
d) 棄固定液，加合適的染色液染色；
e) 染色完畢后用清水洗凈，置于空氣中干燥，
f) 干燥后，用二甲本透明，光學樹脂封片后觀察。

二、免疫組織細胞化學鑒定

1、將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片；
2、PBS  清洗標本 3 次，各 1 分鐘；
3、4% 多聚甲醛固定 15 分鐘；
4、置于空氣中干燥；
5、PBS 清洗標本 3 次，各 2 分鐘；
6、0.5% Triton X-100  孵育 1 次 20 分鐘；
7、PBS 清洗標本 3 次，各 2 分鐘；
8、3% H₂O₂  孵育 15 分鐘；
9、DPBS  清洗標本 3 次，各 2 分鐘；
10、封閉血清孵育（5%  正常二抗血清 DPBS 液 20 分鐘）
11、一抗孵育，4 ℃ 過夜或 37 ℃ 60 分鐘；
12、PBS 清洗標本 3 次，各 5 分鐘；
13、二抗工作液孵育（濕盒）37 ℃ 30 分鐘；
14、PBS 清洗標本 3 次，各 5 分鐘；
15、C 液（濕盒）37 ℃ 30 分鐘；
16、PBS 清洗標本 3 次，各 5 分鐘；
17、用顯色液進行顯色；
18、蒸餾水洗滌 2 次 1 分鐘；
19、蘇木素復染 1 分鐘；
20、清水洗滌 30 分鐘；
21、光學樹脂封片后觀察。
 

原代細胞分離技術


取人或動物體內（或胚胎）的組織，將其剪碎至 1 mm³ 的組織塊，再采用的如下方法進行分離培養：
 

一、懸浮細胞的分離方法


1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉至離心管中，1,000 rpm/分鐘離心 5 分鐘。
2、去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的 PBS 清洗后  1,000 rpm/分鐘離心 5 分鐘。此步重復兩次。
3、用培養基重懸，調整適當細胞濃度后分瓶培養。
4、如選用懸液中某種細胞，可采用離心后的細胞分層液收獲目的細胞。

二、實體組織材料的分離方法
 

（一）機械分散法


1、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至 1 mm³ 的組織塊。
2、用 PBS 清洗兩次后
①用吸管吹打，分散組織細胞。
②或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內（用九號針），使細胞通過針頭壓出。
③或在不銹鋼紗網內用鈍物（注射器鈍端）壓擠使細胞從網孔中壓擠出。
3、收集細胞轉入離心管中，1,000 rpm/分鐘離心 5 分鐘。
4、去上清，加入含血清的培養基，重懸后移至培養瓶中培養。
 

（二）消化分離法


1、酶消化分離法（過夜冷消化法）
①細胞間質較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用 Hanks 液清洗組織三次，剪成碎塊大小為 4 毫米左右。
②再用 Hanks 液洗 2～3 次以除去血球和脂肪組織。
③加入 0.25% 的胰蛋白酶，搖勻后放 4 ℃ 過夜。
④次日再用 Hanks 液洗滌，棄去上清，共洗 2～3 次。
⑤加入少量含血清的培養基吹打分散，細胞計數，按適當的濃度分瓶培養。

2、非酶消化法（EDTA  消化法）
①把組織塊剪碎，呈 1 mm³ 大小的組織塊。
②將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂 PBS 洗 2～3 次。
③加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA）于 37 ℃ 水浴中作用適當時間（中間可輕搖 1～2 次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。
④棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養基中止消化反應，并洗滌 2～3 次后，加入wan全培養基。
⑤用吸管吹打，使細胞充分散開后用紗網過濾后分瓶培養。

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