ELISA試劑盒(酶聯免疫分析測試法)實驗操作中常見問題分析（三）

(4)顯色和比色

TMB 經HRP 作用后，約40 分鐘顯色達ding峰，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可wan全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24 小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15 -30℃ ，使用前先預熱儀器 15-30 分鐘，測讀結果更穩定。

測讀 A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長(W1)，第二次在不敏感波長(W2)，兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 肉眼判斷結果時，顯色淺不易觀察，影響結果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結果一致性。

(5)HooK效應影響

隨著ELISA一步法的應用，一些標本中抗原含量過高，產生HooK效應。影響檢測結果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減HooK反應的發生。

(6)干擾物質的影響

有人認為大約 40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果;常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應物質和其它物質等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發生變構，Fc的C1q分子結合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃30分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP(如孕婦)，在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深影響檢測結果。

(7)藥物的影響

高效價的乙肝免疫球蛋白會與 HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應，導致乙肝兩對半少見模式的出現，如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規注射200mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出;而且其所生產的生新兒也常出現HBsAg陰性，HBeAg 陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進入胎兒體內與胎兒血液中的HBsAg結合形成復合物;則新生兒HBsAg檢測呈陰性;用0.5M的鹽酸處理標本1小時可提高出率。 為預防乙肝，部分 HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出;如電化學發光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內不應作HBsAg檢測。

(8)抗原自身因素

融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷 試劑 盒為例為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列可以與血清中抗大腸桿菌的因子發生反應而產生了可疑標本。少數 HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后絕大多數感染者外周血中可出現HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之間。據文獻報道，到目前為止在獻血員中所發現的HBsAg 攜帶者zui低含量為0.2 ng/ml。含量高者可達2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發性乙型肝炎、HBV的S基因發生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構成病毒外膜，根據所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs應答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決定簇的抗原性發生改變，使機體產生的抗體對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發生在多個部位，而且幾處突變可同時存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態的持續存在。近來，有研究表明，前S1區丟失突變(氨基酸58～118)是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位于前S1，是合成HBsAg的調節元件，前S1的丟失突變則會影響S啟動子的功能，進而影響HBsAg的合成。

總之，優質的 試劑，良好狀態的儀器，排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。