熒光顯微技術(shù)是一種利用熒光團誘發(fā)熒光的顯微技術(shù)，與吸收、散射或反射不同。熒光團（或熒光色素）是一種熒光染料，用于在蛋白質(zhì)、組織和細胞上標記標簽，以便通過熒光顯微鏡進行檢查。熒光團的工作原理是吸收特定波長的能量（通常稱為激發(fā)范圍），并在另一特定波長區(qū)域（稱為發(fā)射范圍）重新發(fā)射該能量。

熒光顯微系統(tǒng)（如外熒光顯微鏡）可以很簡單，而共焦或多光子系統(tǒng)則可能非常復(fù)雜。不過，所有熒光顯微鏡都有相同的基本概念：激發(fā)能量照亮樣品，樣品釋放出微弱但可量化的發(fā)射能量。激發(fā)和發(fā)射波長的中心波長并不相同。這就需要專門的濾光片來增加整體對比度和信號。

圖 1：典型的熒光顯微鏡裝置。

最基本的概念和示意圖見圖 1。濾光片排列由三種類型的濾光片組成：激發(fā)濾光片、分色濾光片和發(fā)射濾光片。 

濾光片 #1：激發(fā)濾光片

激發(fā)濾光片置于熒光顯微鏡的照明路徑中，可濾除除熒光團激發(fā)范圍以外的所有光源波長。濾光片的最小透射率決定了圖像的亮度和光彩。建議任何激發(fā)濾光片的透射率至少為 40%，理想情況下透射率大于 85%。激發(fā)濾光片的帶寬應(yīng)完全在熒光團的激發(fā)范圍內(nèi)，使濾光片的中心波長（CWL）盡可能接近熒光團的峰值激發(fā)波長。激發(fā)濾光片的光密度（OD）決定了背景圖像的暗度；OD 是衡量濾光片阻擋透射范圍或帶寬以外波長的程度。建議最低光密度為 3.0，但理想的光密度為 6.0 或更高。

濾光片 #2：二向色濾光片或分光鏡

二向色濾光片以 45° 角放置在激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片之間，將激發(fā)信號反射到熒光團，同時將發(fā)射信號透射到檢測器。理想的二向色濾光片和分光器在最大反射和最大透射之間有鮮明的過渡，在激發(fā)濾光片的帶寬內(nèi)反射率大于 95%，在發(fā)射濾光片的帶寬內(nèi)透射率大于 90%。選擇濾光片時應(yīng)考慮熒光團的交叉波長 (λ)，以盡量減少雜散光，最大限度地提高熒光圖像的信噪比。

濾光片 #3：發(fā)射濾光片

發(fā)射濾光片置于熒光顯微鏡的成像路徑內(nèi)，濾除熒光團的激發(fā)范圍，同時透射發(fā)射范圍。對激發(fā)濾光片的建議同樣適用于發(fā)射濾光片：最小透射率、帶寬、外徑和中心波長（CWL）。具有理想的 CWL、最小透射率和 OD 組合的發(fā)射濾光片可提供最亮的圖像，同時具有最深的遮擋，并能確保檢測到最微弱的發(fā)射信號。

圖 2：通用熒光團光譜曲線。

圖 2 顯示了典型的激發(fā)和發(fā)射曲線。吸收和發(fā)射曲線具有共同的波長，這也是為什么需要具有高透射率、窄帶寬、高外徑以及銳利的導通和截止帶的高質(zhì)量濾光片的原因之一。使用劣質(zhì)濾光片最終會損壞樣品、試樣或昂貴的傳感器。請聯(lián)系我們，我們將幫助您選擇適合您應(yīng)用的濾光片。

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