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杭州實了個驗生物科技有限公司
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瀏覽次數賽默飛實時熒光定量PCR儀的工作流程
賽默飛實時熒光定量PCR儀（如ViiA™ 7、7500、QuantStudio系列）以其高精度和多功能性廣泛應用于分子生物學實驗。要實現高效、準確的實驗結果，遵循標準化的工作流程至關重要。以下是賽默飛實時熒光定量PCR儀的詳細工作流程，從樣品準備到數據分析的每個環節均作了詳盡說明。
1. 實驗準備階段
(1) 樣品準備
核酸提取：
從細胞、組織或其他樣品中提取目標DNA或RNA模板。
如果是RNA樣本，需使用逆轉錄酶將RNA轉錄為cDNA。
確保核酸的純度和濃度符合實驗要求（如無抑制劑殘留）。
樣品定量與質量檢測：
使用分光光度計或熒光計檢測核酸濃度和純度（260/280比值在1.8-2.0之間）。
通過電泳確認樣品完整性。
(2) 配制PCR反應體系
選擇試劑：
根據實驗需求選擇熒光染料法（如SYBR Green）或熒光探針法（如TaqMan探針）。
PCR反應混合液配制：
按以下配比準備PCR反應液（總反應體積10-50 μL）：模板DNA或cDNA（1-100 ng）；
引物（正向和反向，引物濃度一般為200-500 nM）；
熒光染料或探針（探針濃度一般為100-200 nM）；
dNTPs、Taq DNA聚合酶和緩沖液；
去離子水補足反應體積。
分裝反應液：
將PCR反應液分裝至96孔或384孔光學反應板中，每孔體積一致，避免氣泡產生。
進行密封（使用光學透明薄膜或封板蓋）并短時間離心，使反應液集中到底部。
(3) 儀器檢查
檢查儀器是否已正確連接到電源和電腦。
打開儀器軟件，確保光學模塊和溫控模塊運行正常。
檢查反應板對齊是否正確，避免樣品孔偏移影響熒光信號采集。
2. 實驗運行階段
(1) 加載反應板
打開儀器樣品艙門，將密封好的反應板或試管架放置在托盤上。
確保反應板正確對齊，避免孔位偏移影響光學檢測。
(2) 設置實驗參數
在賽默飛軟件（如QuantStudio或7500軟件）中進行實驗設置：
實驗類型選擇：
絕對定量：用于精確定量目標核酸。
相對定量：用于基因表達變化分析。
熔解曲線分析：檢測擴增產物的特異性或突變分析。
根據實驗目標選擇適合的實驗類型，如：
樣品信息輸入：
定義樣品名稱、分組信息和孔位分布。
設置目標基因和參考基因的信息。
熒光通道設置：
根據熒光探針或染料選擇檢測通道（如FAM、VIC、SYBR Green等）。
熱循環程序設置：
常規PCR循環參數如下：變性：95℃，15秒；
退火/延伸：60℃，30秒；
初始變性：95℃，2分鐘；
循環階段（重復30-40次）：
熔解曲線分析（如適用）：從60℃升溫至95℃，每0.5℃記錄熒光信號。
(3) 啟動實驗
確認所有參數無誤后，點擊 “運行實驗"。
儀器開始循環加熱并實時采集熒光信號，生成擴增曲線。
3. 實驗完成與數據分析階段
(1) 檢查實驗完成狀態
儀器完成實驗后，軟件會提示實驗成功完成。
取出反應板并安全存放，以備后續驗證或重復實驗。
(2) 數據分析
查看擴增曲線：
檢查擴增曲線是否呈現典型的S形曲線，確認擴增反應的有效性。
平穩的S形曲線表明擴增反應正常。
Ct值計算：
Ct值（Threshold Cycle）是熒光信號達到設定閾值的循環數。Ct值越小，說明模板起始量越高。
軟件會自動計算每個樣品的Ct值。
標準曲線分析（用于絕對定量）：
根據標準品的Ct值繪制標準曲線，計算未知樣品的濃度。
相對定量分析：
比較目標基因與參考基因的表達水平，計算相對表達量（通常使用ΔΔCt法）。
熔解曲線分析（用于SYBR Green染料法）：
檢查擴增產物的特異性。單一峰值表明擴增特異性良好；多峰值可能提示非特異性擴增或引物二聚體形成。
(3) 數據導出與保存
將實驗數據保存為軟件支持的文件格式（如 .eds 或 .xls），便于后續分析和報告撰寫。
4. 儀器清理與維護
(1) 清理樣品托盤
實驗完成后，用無塵布清潔樣品托盤，確保無殘留液體或雜質。
(2) 光學模塊清潔
每周用光學專用清潔液輕輕擦拭光學窗口，避免灰塵或指紋干擾熒光檢測。
(3) 定期校準
每3-6個月校準一次溫控模塊和光學檢測系統，確保儀器性能穩定。
5. 注意事項
樣品制備：
確保核酸樣品無污染，提取過程使用無RNase、無DNase的耗材。
模板濃度適中，避免過量或過稀導致非特異性擴增。
試劑配制：
使用新鮮的試劑，避免因試劑降解導致實驗失敗。
儀器環境：
將儀器放置在干燥、無振動的實驗環境中，保持室內溫度和濕度穩定。
操作規范：
密封反應板時，確保無氣泡干擾光學檢測。
運行實驗時避免中途打開樣品艙門。
總結
賽默飛實時熒光定量PCR儀的工作流程涵蓋樣品準備、儀器設置、實驗運行和數據分析等多個環節。通過嚴格遵守標準操作流程和注意事項，用戶可以充分利用儀器的高靈敏度和高精度特點，獲得可靠的實驗數據。同時，定期維護和校準儀器可以確保長期穩定的性能，為實驗室研究提供強有力的技術支持。
