聯系電話
杭州實了個驗生物科技有限公司
中級會員·2年
提 供 商
資料大小
資料類型
資料圖片
下載次數
瀏覽次數使用賽默飛實時熒光定量PCR儀測定Tm值的原理與應用
一、引言
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種廣泛應用于分子生物學、醫學診斷、食品安全和環境檢測等領域的核酸擴增技術。實時熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）在傳統PCR的基礎上引入了熒光探針或染料，使得反應進程可以實時監測。熔解溫度（Tm，Melting Temperature）作為核酸雙鏈解鏈過程中的一個關鍵參數，能夠為引物特異性分析、突變檢測、產物鑒別等提供重要依據。
賽默飛科技生產的實時熒光定量PCR儀因其靈敏度、通量和數據分析能力，在多個實驗室中得到廣泛使用。本文將詳細介紹如何利用賽默飛實時熒光定量PCR儀進行Tm值的測定，并探討該過程的技術原理、實驗步驟及其應用價值。
二、Tm值的基本概念與意義
熔解溫度（Tm值）是指雙鏈DNA變性為單鏈時的溫度，此時有50%的雙鏈DNA分子解鏈。Tm值受DNA序列長度、GC含量、離子濃度、DNA濃度等因素影響。測定Tm值對于以下方面具有重要意義：
引物和探針設計優化：確保擴增的特異性和效率。
產物鑒別：通過熔解曲線識別不同的擴增產物或雜交探針的結合差異。
SNP和突變檢測：通過微小Tm值差異區分單核苷酸變異。
驗證擴增特異性：避免非特異性擴增對結果造成干擾。
三、儀器原理與檢測機制
賽默飛的實時PCR系統通常采用SYBR Green I或TaqMan探針等熒光標記方式來監測DNA擴增。對于Tm值測定，多采用SYBR Green染料，其在雙鏈DNA存在時發出熒光，單鏈時熒光迅速降低。通過逐步升溫并記錄熒光變化，即可繪制出熔解曲線，進一步計算Tm值。
儀器通過以下機制測定Tm值：
熒光信號采集：在升溫過程中持續監測SYBR Green的熒光變化。
熔解曲線分析：熒光信號隨溫度升高而下降，取導數（-dF/dT）后得到Tm峰值。
軟件計算與輸出：賽默飛的軟件可自動識別Tm峰值并輸出精確數據。
四、實驗準備與操作步驟
1. 試劑準備
qPCR Master Mix（含SYBR Green）
引物（Forward/Reverse）
模板DNA
無RNA酶水
2. 反應體系配置（以20 µL體系為例）
| 組分 | 體積（µL） |
|---|---|
| SYBR Green Mix | 10 |
| 上游引物（10 µM） | 0.8 |
| 下游引物（10 µM） | 0.8 |
| 模板DNA | 1 |
| 無RNA酶水 | 7.4 |
| 總計 | 20 |
3. PCR反應程序設定
初始變性：95℃，2分鐘
循環步驟（40個循環）：
變性：95℃，15秒
退火/延伸：60℃，30秒
熔解曲線分析：
起始溫度：60℃
終止溫度：95℃
升溫速率：0.3~1℃/s，持續監測熒光
4. 數據獲取與Tm值分析
實時監測熒光并記錄擴增曲線
啟動熔解曲線模塊，導出-dF/dT vs. T圖形
Tm值對應曲線峰值所在溫度
五、結果判讀與質量控制
1. 熔解曲線解析
單一Tm峰：代表擴增產物高度特異，說明實驗設計合理。
多重Tm峰：提示非特異擴增或引物二聚體存在，需優化引物或反應條件。
Tm值偏低或偏高：可能為GC含量異常或體系緩沖液濃度偏差。
2. 影響Tm值的因素
GC含量：GC對DNA穩定性貢獻高，Tm值隨GC比例升高而提高。
引物長度：短引物Tm低，建議設計長度為18~25 bp。
鹽濃度：高離子強度能穩定雙鏈DNA，提高Tm值。
DNA濃度：模板過多可能引起熔解曲線畸變。
染料濃度與兼容性：需選擇適合儀器和應用的染料。
六、典型應用舉例
1. 突變檢測（如SNP分析）
通過引物或探針與目標序列結合后的Tm差異識別堿基突變。例如，某位點A→G突變可導致Tm值從78.5℃變為76.3℃。
2. 引物篩選
在多個候選引物中，通過測定Tm值及熔解曲線形態選出特異性強、產物純凈的引物組合。
3. 產物鑒定
針對擴增產物的Tm值進行比對，輔助確認擴增物是否為預期序列，尤其適用于無電泳分析條件下的高通量實驗。
七、注意事項與實驗優化建議
引物設計軟件推薦使用Primer3、Oligo等，并確保Tm值相近（差值≤2℃）。
設定熔解曲線前應關閉擴增熒光，以避免干擾。
若發現Tm值波動較大，建議優化Mg2?濃度、PCR循環參數或更換試劑批次。
對多重PCR反應，Tm值分布應盡量錯開，便于識別各目標產物。
八、結語
通過實時熒光定量PCR儀測定Tm值，實驗人員可以獲得關于擴增特異性、產物性質、突變識別等多方面的重要信息。賽默飛實時PCR平臺配合高分辨率熔解曲線分析功能，使得Tm值測定更為精準、穩定。該技術在基因分型、病原檢測、轉基因篩查等場景中已得到廣泛應用。合理利用這一工具，能夠顯著提高實驗效率與數據質量。
如果你還需要加入具體軟件截圖操作、實例圖譜說明或針對某一儀器型號（如QuantStudio系列）進行補充，我可以繼續為你細化內容。
