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杭州實了個驗生物科技有限公司
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瀏覽次數實時熒光定量PCR儀簡介
一、引言
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）是一種在體外擴增特定DNA片段的技術。自1983年誕生以來，PCR技術在生命科學研究、醫學診斷、環境監測、食品安全、法醫鑒定等領域得到廣泛應用。隨著分子生物學的發展，傳統PCR已逐漸無法滿足對靈敏度、準確性、定量能力的更高需求。因此，實時熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，簡稱qPCR）應運而生。
實時熒光定量PCR儀是一種結合熒光探針或染料信號，實現DNA擴增與實時檢測的高通量分子檢測設備。本文將圍繞其基本原理、儀器結構、工作流程、數據分析、技術優勢及應用等方面進行系統介紹。
二、實時熒光定量PCR的基本原理
1. 核酸擴增原理
實時熒光定量PCR與傳統PCR的基本擴增機制相同，均基于三步循環：
變性（Denaturation）：高溫使雙鏈DNA分離為兩條單鏈；
退火（Annealing）：降低溫度，使引物結合到模板DNA上；
延伸（Extension）：DNA聚合酶延伸引物，合成新的DNA鏈。
每個循環都會使目標DNA數量翻倍，經過30~45個循環后即可獲得大量擴增產物。
2. 熒光定量原理
實時PCR通過加入熒光標記物，在每一輪擴增過程中同步檢測熒光強度的變化，從而反映DNA的累積量。其定量方式主要有兩種：
染料法（如SYBR Green）：染料可與雙鏈DNA結合并發出熒光，隨DNA濃度增加熒光增強。
探針法（如TaqMan探針、MGB、Molecular Beacon）：通過序列特異性探針的熒光信號變化監控擴增，特異性更高。
熒光信號被檢測器記錄，繪制出擴增曲線，從而實現定量分析。
三、儀器結構與功能模塊
實時熒光定量PCR儀主要由以下幾個部分組成：
1. 熱循環模塊
負責提供精確的溫控環境，確保PCR擴增反應的溫度條件，包括變性、退火、延伸及熔解過程。該模塊通常采用半導體控溫系統，溫度控制精度在±0.1℃以內。
2. 光學檢測系統
包含激發光源、濾光片、光路系統和熒光檢測器。激發光源（如LED或激光器）激發熒光染料，熒光信號通過濾光片傳輸到CCD或光電倍增管進行記錄。多通道檢測系統可同時監控多種熒光信號，用于多重PCR反應。
3. 控制與分析軟件
用于實驗設置、數據采集、擴增曲線分析、Ct值計算、標準曲線建立、熔解曲線繪制等。軟件界面通常具備參數可視化、結果導出、模板管理等功能。
4. 樣本模塊
樣本通常裝載于96孔、384孔或較小通量的反應板、管條中，有些儀器還支持快熱系統以縮短反應時間。
四、工作流程
1. 樣本準備
提取目標樣本中的DNA或RNA（RNA需逆轉錄為cDNA），并準確定量。引物與探針設計需依據目標序列，避免二聚體和非特異性結合。
2. 配制反應體系
一般包括以下成分：
DNA模板
上下游引物
熒光染料或探針
PCR緩沖液、Mg2?、dNTPs
熱啟動DNA聚合酶
3. 設置程序參數
包括初始變性時間、循環次數、各階段溫度與時間、熔解曲線分析等。染料和探針類型不同可能需要調整檢測通道。
4. 實驗運行與數據采集
儀器自動完成循環擴增和熒光信號采集，實驗結束后通過軟件分析數據，獲取Ct值、Tm值、擴增效率等信息。
五、Ct值與定量原理
1. Ct值定義
Ct（Cycle threshold）值是指熒光信號超過背景閾值所對應的擴增循環數。Ct值越小，代表初始模板濃度越高。
2. 相對定量與絕對定量
相對定量：使用內參基因作為對照，計算目標基因的表達變化，常用2^-ΔΔCt方法。
絕對定量：通過標準曲線法，根據Ct值與模板拷貝數的對數關系，精確測量未知樣本中目標基因的拷貝數。
六、與傳統PCR的比較
| 項目 | 傳統PCR | 實時熒光定量PCR |
|---|---|---|
| 檢測方式 | 電泳后檢測 | 實時熒光檢測 |
| 是否定量 | 否 | 是 |
| 靈敏度 | 中 | 高 |
| 特異性 | 依賴引物設計 | 探針法特異性更高 |
| 時間成本 | 較長（需電泳） | 較短（無需后處理） |
| 數據輸出 | 定性結果（條帶） | 定量曲線和Ct值 |
七、常見問題與解決策略
1. 非特異性擴增
可能由引物設計不當、退火溫度過低或引物濃度過高引起，可通過優化退火溫度、重新設計引物、調整引物濃度解決。
2. 引物二聚體產生
主要表現為熔解曲線出現低Tm值小峰，通過使用熱啟動酶、優化引物設計或調整PCR體系濃度可緩解。
3. 熒光信號弱
可能由反應體系抑制、模板降解或引物效率低導致，需檢查模板質量，優化引物或提高反應體系兼容性。
4. 多重通道串擾
應校準濾光片組或檢測通道，確保熒光染料之間不發生交叉干擾。
八、技術應用領域
1. 基因表達分析
通過檢測不同處理、組織或時間點中基因的表達量變化，廣泛應用于轉錄調控、信號通路研究等。
2. 病原體檢測
利用qPCR高靈敏度，可快速檢測病毒、細菌、真菌等病原體DNA/RNA，廣泛用于臨床診斷與疫情監測。
3. 基因分型與突變分析
通過Tm值變化或探針結合位點識別不同等位基因，用于SNP檢測、遺傳多態性研究。
4. 轉基因篩查
針對轉基因作物中特定外源基因序列進行檢測，可實現定量檢測與溯源追蹤。
5. 微量核酸檢測
適用于循環DNA（cfDNA）、微量殘留病毒等極低拷貝數樣本的檢測，配合數字PCR可進一步提高分辨率。
九、發展趨勢與技術創新
隨著分子診斷、個體化醫療等領域的發展，實時熒光定量PCR技術也不斷演進，呈現出以下趨勢：
自動化：集成樣本制備、擴增和檢測，提高實驗效率。
便攜化：發展移動式實時PCR設備，適應現場檢測需求。
高通量：支持384孔板、多通道檢測，提高數據產出。
精準分析：與數字PCR、高分辨率熔解曲線（HRM）技術結合，拓展應用邊界。
十、結語
實時熒光定量PCR儀通過結合熱循環擴增技術與熒光信號監測系統，實現了DNA擴增的實時、定量分析，為科研、醫學、農業、司法等多個領域提供了強有力的技術支撐。其高靈敏度、穩定性和數據可追溯性，使其成為現代分子生物學實驗中的常用工具。未來，隨著自動化與智能化水平的提升，實時PCR技術將在更多場景中發揮作用。
