聯系電話
杭州實了個驗生物科技有限公司
中級會員·2年
提 供 商
資料大小
資料類型
資料圖片
下載次數
瀏覽次數羅氏實時熒光定量PCR儀工作原理詳解
一、引言
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）自上世紀80年代問世以來，極大地推動了分子生物學、醫學檢測、環境監測、法醫學和食品安全等多個領域的發展。傳統PCR的終點分析具有一定的局限性，僅能判斷是否擴增成功，難以實現實時監控與定量分析。實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）技術應運而生，解決了這一問題。
羅氏公司研發的 LightCycler® 系列實時熒光定量PCR儀，基于實時熒光檢測與熱循環技術，集成了溫控系統、光學檢測模塊及數據處理系統。本文將系統介紹其工作原理、技術結構及相關參數，為理解儀器操作原理和合理使用提供理論依據。
二、實時熒光定量PCR的基本原理
實時熒光定量PCR儀的核心在于實時監測DNA擴增過程中熒光信號的變化，通過熒光染料或探針報告擴增產物的累積量，最終實現對初始模板的定量分析。
其基本過程包括：
模板擴增（DNA復制）
熒光信號產生（通過染料或探針）
信號采集與分析（每一循環實時讀取）
1. 擴增原理
PCR擴增由三個基本步驟循環構成：
變性（Denaturation）：95°C，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；
退火（Annealing）：50–65°C，引物與模板DNA特異性結合；
延伸（Extension）：72°C，在Taq酶作用下合成新鏈。
每一輪擴增，理論上目標序列數量會倍增，經過30–40個循環后即可達到可檢測水平。
2. 熒光標記方法
熒光定量PCR的實現依賴于熒光染料或探針系統的加入。目前主要采用以下幾種檢測體系：
SYBR Green I染料：與雙鏈DNA結合后發出熒光，適用于通用引物體系；
TaqMan探針：結合目標序列后被酶切斷產生熒光釋放，特異性強；
分子信標（Molecular Beacon）與Scorpion探針：通過構象變化實現熒光釋放；
FRET探針：兩個探針之間發生熒光共振能量轉移，用于高特異性檢測。
3. 熒光檢測與Ct值概念
每一輪循環結束后，設備通過激發光照射樣品，記錄熒光強度變化。熒光值超過設定閾值的循環數被稱為Ct（Threshold Cycle），其與起始模板數量呈負相關關系：
初始模板越多，Ct值越小；
Ct值差異可反映樣品間表達量差異。
通過繪制標準曲線或采用ΔΔCt法，可進行絕對或相對定量分析。
三、羅氏LightCycler® 系統構造與功能模塊
羅氏 LightCycler® 實時熒光定量PCR儀由以下四大模塊構成：
1. 溫控系統
構造
使用帕爾貼元件進行快速加熱與降溫；
96孔金屬模塊與熱蓋形成封閉反應環境；
多點溫度傳感器進行實時監控與調節。
功能
確保每一孔溫度一致；
準確執行復雜的熱循環程序；
快速升降溫縮短實驗時間，提高效率。
2. 光學檢測系統
光源
多通道激發光源（如LED）激發不同熒光染料；
激發波長穩定，能量可控。
檢測器
采用光電二極管或光電倍增管；
不同波段濾光片組合可實現FAM、HEX、ROX、Cy5等染料識別。
工作流程
在每一循環結束后，系統進行熒光激發；
熒光信號通過光路系統傳輸至探測器；
同步讀取多個通道信號，支持多重檢測。
3. 樣品托盤與反應板
采用標準96孔PCR板，方便兼容市場主流耗材；
熱蓋自動調節壓力，防止蒸發；
金屬材質確保良好的熱傳導性。
4. 控制與分析系統
通過USB或網絡接口連接控制計算機；
使用 LightCycler® 軟件進行程序設置、數據采集與圖像分析；
支持實時曲線、熔解曲線、標準曲線繪制等功能。
四、典型檢測流程解析
1. 實驗設計
選擇適合的熒光系統（染料或探針）；
設計特異性引物；
準備PCR反應體系（包含模板、引物、酶、dNTP等）；
2. 程序設置
在軟件中設定熱循環程序，包括：
預變性時間與溫度；
每步溫度、時間、循環次數；
采集熒光的通道與時間點。
3. 擴增及實時檢測
啟動反應，儀器自動執行升降溫與熒光采集；
實時生成擴增曲線，觀察反應動態；
監測不同通道間數據變化，判斷是否為特異性擴增。
4. 數據分析
提取Ct值；
應用ΔCt或ΔΔCt法計算表達量變化；
生成標準曲線用于絕對定量；
判斷熔解曲線是否存在非特異產物或引物二聚體。
五、熔解曲線分析原理（適用于SYBR Green法）
在擴增結束后，通過升溫過程記錄雙鏈DNA解鏈產生的熒光下降，得到熔解曲線：
每一個特異產物對應一個特定的熔解溫度（Tm）；
若存在多個Tm峰，提示可能存在非特異擴增或引物二聚體；
可通過曲線平滑、導數計算等方式進行圖像識別。
六、影響熒光信號準確性的因素
| 因素 | 影響表現 | 建議解決方法 |
|---|---|---|
| 熒光染料濃度 | 過高造成背景信號增加 | 優化反應濃度 |
| 引物二聚體 | 假陽性Ct值 | 設計引物時避免互補區 |
| 光學污染 | 信號不穩定或偏差大 | 定期清潔檢測窗口 |
| 溫控偏差 | 擴增效率不均 | 定期校準溫控模塊 |
七、工作原理的應用示例
1. 基因表達分析
利用qPCR檢測轉錄本豐度，常用于疾病機制研究、藥效評估、轉基因檢測等。
2. 病原體檢測
檢測病毒DNA/RNA（如SARS-CoV-2、HPV、HBV等），適用于臨床診斷和大規模篩查。
3. 拷貝數變異（CNV）分析
通過對比Ct值計算基因組中某一區域的拷貝數變化，用于腫瘤研究或遺傳病篩查。
八、未來技術趨勢
雖然實時熒光PCR已趨成熟，但其工作原理不斷被擴展與優化，主要方向包括：
數字PCR（dPCR）：基于微液滴分隔的絕對定量技術；
微流控PCR芯片：小型化平臺適用于現場快速檢測；
自動化平臺整合：與樣品前處理、數據云分析系統協同工作。
九、結語
羅氏實時熒光定量PCR儀通過整合精確的溫控技術與多通道光學檢測系統，實現了對DNA擴增過程的實時監控與定量分析。其工作原理遵循分子生物學與物理光學的基本規律，構建出一個高效的數據生成平臺。在掌握其原理基礎上，科研人員可更加準確地設計實驗、評估數據質量，并進一步拓展其在各類分子分析中的應用潛力。
