CRISPR 技術(shù)是什么？

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相關(guān)蛋白 9 (Cas9) 系統(tǒng)是一種簡單快速有效的方法，可直接在細(xì)胞中對基因序列進(jìn)行更改。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)源自簡單細(xì)菌免疫系統(tǒng)的組分，能夠在多種細(xì)胞中進(jìn)行靶向基因切割和基因編輯。

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由于 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中的核酸內(nèi)切酶切割特異性由 RNA 序列引導(dǎo)，因此通過對向?qū)?RNA (gRNA) 序列進(jìn)行工程改造，并將其與 Cas9 核酸內(nèi)切酶一起遞送至靶細(xì)胞內(nèi)后，幾乎可以對任何基因組位點(diǎn)進(jìn)行編輯。

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)高度靈活性和特異性靶向性，可進(jìn)行修飾和重定向，也已成為干細(xì)胞工程、基因治療、組織和動物疾病模型以及設(shè)計(jì)抗病轉(zhuǎn)基因植物等廣泛應(yīng)用中的強(qiáng)大基因組編輯工具。賽默飛世爾科技的專家已整合該一系列資源，您可以放心地開始基因編輯或持續(xù)改進(jìn)您的研究。

CRISPR 是如何工作的？

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)由非編碼短 gRNA 和 Cas9 核酸酶組成（圖 1）。gRNA 有兩個分子組分：一個靶點(diǎn)特異性 CRISPR RNA (crRNA) 和一個輔助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 單元將 Cas9 蛋白引導(dǎo)至特定基因組位點(diǎn)，Cas9 核酸酶在該位點(diǎn)誘導(dǎo)特定基因組靶序列的雙鏈斷裂（圖 2）。

圖 1.CRISPR gRNA 和 Cas9 蛋白。

圖 2.CRISPR-Cas9 系統(tǒng)。

在細(xì)菌中，CRISPR 位點(diǎn)由一系列重復(fù)序列組成，這些重復(fù)序列被 30bp 左右長度的外源 DNA 間隔開來，這些外源 DNA 稱為間隔區(qū)序列（spacer）。重復(fù)-間隔的陣列被轉(zhuǎn)錄為一條較長的前體RNA，其中的重復(fù)序列被加工并生成定義了靶標(biāo)序列的短小 crRNA（也稱為前間區(qū)序列（protospacer）） - 靶序列據(jù)此被 Cas9 核酸酶切割。之后人們將CRISPR間隔區(qū)序列作為在DNA水平識別和沉默外源基因元件的工具。

重要的是，緊鄰靶區(qū)域 3'端下游的稱為原型間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 序列的特定三核苷酸序列必須存在才能發(fā)生切割。該 PAM 序列 (Cas9 的 NGG) 存在于靶 DNA 中，但不存在于靶向該 DNA 的 gRNA 中。

使用 CRISPR-Cas9 切割 DNA 后，雙鏈斷裂可以通過兩種細(xì)胞自然修復(fù)機(jī)制之一進(jìn)行修復(fù)（圖 3）。

1. 在不存在修復(fù)模板的情況下，非同源末端連接(NHEJ) 過程會導(dǎo)致 gRNA 定義的斷裂周圍有不同插入或缺失（插入缺失）的異質(zhì)細(xì)胞群。可利用該過程在特定序列周圍生成有隨機(jī)缺失的細(xì)胞系，從而獲得功能性敲除。

2. 或者，如果提供了修復(fù)模板，則可以通過無差錯的同源定向修復(fù) (HDR) 機(jī)制，在基因組內(nèi)的特定位點(diǎn)引入用戶定義的序列變化。該過程可用于過表達(dá)新基因，建立疾病相關(guān)細(xì)胞模型或用可報(bào)告的基團(tuán)標(biāo)記內(nèi)源性基因。

圖 3.CRISPR-Cas9 雙鏈斷裂和修復(fù)通路。切割反應(yīng)同時發(fā)生于兩條鏈中靶序列的3’端 PAM 序列上游 NGG 的 3 個堿基對上。

使用 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的成功秘訣

如果選擇 CRISPR-Cas9 進(jìn)行基因編輯工作流程，請確保了解使用本系統(tǒng)時可能會影響基因組編輯效率的因素。重要的是要考慮您的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括用于切割的核酸酶形式和 gRNA，將分子遞送到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染方法以及檢測基因編輯以適當(dāng)驗(yàn)證結(jié)果所需的檢測。

設(shè)計(jì)和構(gòu)建

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時的關(guān)鍵注意事項(xiàng) ：

? 為每個靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和檢測 3 個 gRNAs

? 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇預(yù)測的脫靶效應(yīng) gRNAs

? 靶向早期組成型外顯子，破壞基因敲除實(shí)驗(yàn)的閱讀框

? 確保切割位點(diǎn)盡可能接近編輯位點(diǎn)，以進(jìn)行敲入實(shí)驗(yàn)

? 選擇適合實(shí)驗(yàn)的 Cas9 核酸酶

遞送

進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時的關(guān)鍵考慮因素 ：

? 從最佳的細(xì)胞密度和細(xì)胞健康狀態(tài)開始

? 了解轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最佳方法：脂質(zhì)體、電穿孔轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)染

? 優(yōu)化遞送多分子時的數(shù)量比

? 轉(zhuǎn)染經(jīng)驗(yàn)證的對照 gRNA，以檢測轉(zhuǎn)染效率和 Cas9 活性

? 提供修復(fù)模板，以便在 Cas9 激活時可進(jìn)行  敲入實(shí)驗(yàn)

檢測和驗(yàn)證

檢測編輯時的主要考慮因素 ：

? 使用基因組切割檢測 (GCD) 試驗(yàn)快速確認(rèn) gRNA 切割效率

? 選擇適合下游應(yīng)用的檢測方法

? 如果需要遺傳同質(zhì)細(xì)胞群，請分離克隆

? 要知道，基于插入缺失的敲除的 gRNA 通常是敲入的 gRNA

? 利用靶向測序驗(yàn)證脫靶編輯

可用的 CRISPR 技術(shù)

賽默飛世爾科技提供一整套基因組編輯試劑（圖 4）。我們會根據(jù)您的應(yīng)用和細(xì)胞類型，為這些基因編輯解決方案匹配最佳的細(xì)胞培養(yǎng)試劑、遞送方法以及分析工具。

圖 4.可用的 CRISPR-Cas9 核酸酶和 gRNA 形式。

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