1999年，一名患有鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏癥的患者接受一劑攜帶校正基因的腺病毒載體注射，產生大規模免疫反應，導致多器官衰竭和腦死亡。由于1999到2002年遭遇的這一事故和其他臨床挫折，基因治療領域的投資在隨后的幾年中經歷了急劇而持續的下降。

但與此同時，為了確保將外源DNA更安全地引入哺乳動物細胞和生物體中，技術革新仍在繼續。例如，基因遞送系統的改進使得細胞因子、siRNA和其他基因替代策略的遞送更安全，且在體外、體內臨床前和臨床應用中都體現出了有效性。

分類和基本概念

廣義的基因治療的概念即將外源性基因遞送到靶細胞，以調節、改變基因組的表達。主要有三種不同的方法（圖1）。基因遞送載體的主要特征和組成在很大程度上取決于使用的基因治療方法（如表一）。

· 基因增補：該方法通常用于面對遵循常染色體隱性遺傳模式的遺傳性疾病，多用的多核苷酸為質粒 (pDNA)，而由質粒介導的轉染通常只能保持1~2個月；另一種常用的為單鏈mRNA，它的穩定時間更短，僅約1小時。

· 基因抑制：該方法主要用于沉默突變基因的表達。這這種情況常見于常染色體顯性遺傳之后的遺傳性疾病模式。抑制序列可以是基于單鏈RNA的結構，如microRNA (miRNA)，或雙鏈RNA結構，如小干擾RNA (siRNA)。

· 基因編輯：用特定的基因編輯工具糾正突變基因，如CRISPR/Cas9。如CRISPR/Cas9的基因編輯工具可以用不同的載體進行遞送，如pDNA、mRNA或核糖核蛋白 (RNP)復合物，以作用于不同的細胞區域。

圖1 三種不同類型基因治療（廣義）示意圖。a) 基因增補療法；b)  基因抑制療法；c) 基因編輯

表1 寡核苷酸基因治療中使用的主要多核苷酸的基本特征和性質示意圖

病毒載體和非病毒載體

載體是目的基因到達其目標目的地的載體，它在產品的安全性和有效性上起到了至關重要的作用。常見的遞送載體可分為病毒載體和非病毒載體。當前一部分的臨床研究已經應用了非病毒載體，但更多的還是保持了傳統的病毒載體系統。

目前市場上有超過20種基因治療產品，其中3種為非病毒產品（如表2），其余均采用病毒載體遞送系統。Neovasculogen是第一個非病毒基因治療產品，由人類干細胞研究所（俄羅斯）開發。它由編碼血管內皮生長因子（VEGF-165）的質粒作為載體。第二個產品是Collategene，一種編碼AnGes（日本）開發的人肝細胞生長因子（HGF）基因的質粒DNA。

表2 使用非病毒載體遞送的基因治療產品

病毒載體可以高效遞送基因，有效生成持續修飾的哺乳動物基因組。但同時，它們也存在一些限制和缺點。

1. 使用逆轉錄病毒（包括慢病毒）載體存在插入誘變的風險；

2. 使用病毒載體，免疫原性反應和炎癥增強的風險增加；

3. 當病毒DNA作為外來DNA引入哺乳動物細胞時，它容易出現表觀遺傳沉默；

4. 病毒生產所需的成本高，對于大規模商業化生產控制成本并不友好。

非病毒載體可以一定程度上避免病毒載體的限制，它具有以下優勢：

1. 使用非病毒載體更容易實現大規模生產和化學表征，能夠大規模提高生產的可重復性；

2. 非病毒載體具有更高的載量，更大的轉基因能力；

3. 使用非病毒載體毒性低，免疫原性反應小，安全性更高。

然而依然有一定的壁壘存在。與病毒載體系統相比，非病毒系統的效率仍然相對較低，因為編碼轉基因的表達仍然是短暫的。為了克服非病毒載體固有的挑戰，仍然需要進行技術的優化和革新以確保非病毒系統的穩定性和有效性。

非病毒載體在體外細胞治療領域的應用

在體外細胞治療領域，除了常見的用逆轉錄病毒或慢病毒載體引入CAR基因的方式，還有轉座子、mRNA、CRISPR/Cas9的方式。

· 轉座子：轉座子由一個攜帶CAR的質粒和一個攜帶轉座子酶的質粒組成。它具有裝載量大、安全性高等優勢。這類新系統已證明能夠實現較為安全的基因整合，同時保持高效的遞送效率，有限的脫靶效應，并可以生成基因表達穩定可靠的轉基因細胞。常見的轉座子系統有睡美人轉座子（Sleeping Beauty，SB），PiggyBac等。

· mRNA: mRNA電穿孔是將CAR基因導入T細胞的方法，但是可以轉染的基因容量更小，轉染效率相對于病毒載體以及轉座子而言都要更低。不過這種方法相對而言成本更低，耗時更短，安全性相對較好，沒有插入誘變，并且免疫原性可以忽略不計。

· CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9基因編輯技術是當前使用最為廣泛的基因編輯技術，它可以通過敲除TRAC等分子，避免GVHD和免疫排斥使CAR-T變成通用型；還可以敲除免疫檢查點或抑制性分子來提高T細胞或者其它免疫細胞的功能。

無論哪種非病毒技術，都需要將外源基因通過一種高效的方法導入到大量的細胞中。電穿孔已被證明是非病毒轉染中前景、且已經是應用最為廣泛的技術之一。

電穿孔技術的應用

目前已上市的電穿孔平臺，存在以下缺點：

· 平臺不開放，參數調整優化難

· 體系放大一致性欠佳，工藝開發生產轉化難

· 亦或是商業模式不大友好，使用成本高昂

尋找降本增效的電轉方案是行業一致的訴求。

在電轉技術方面，賽默飛早有儲備。10多年前賽默飛已推出了Neon電轉系統，N在高校和科研院所廣泛應用，在免疫細胞中基因編輯領域積累豐富經驗。基于與細胞治療領域專業客戶的多年深度合作，賽默飛于2022年推出Gibco™ CTS™ Xenon™大規模電轉染系統，保持了與Neon一致的脈沖配置和開放的操作平臺，通過簡單的優化，即可實現研發到生產的體系放大。此外，滿足大體積、符合GMP生產需求的Xenon也不會收取任何license fee或milestone費用，真正做到降本增效。

圖2 Gibco™ CTS™ Xenon™大規模細胞電轉染系統

Gibco CTS Xenon 電轉染系統特點

· 處理量大且快速：處理量為1–25mL，25分鐘內能夠轉染多達2.5x10?個T細胞；

· 性能可靠，可保持高細胞活力：高達90%的基因敲除效率和80%的細胞活力；

· 工藝靈活性高：儀器配備了用戶可編程系統，允許用戶在細胞治療的工藝開發到商業化生產的所有階段，根據各種細胞類型和目標遞送物創建并優化電轉染方案；

· 非病毒性物理轉染：可用于遞送DNA、RNA和蛋白質；

· 封閉式系統處理工藝：MultiShot(MS)耗材可以無菌焊接至PVC管或C-Flex管。

Gibco CTS Xenon 電轉染系統特應用案例

1. Gibco™ CTS™ Xenon™實現高效T細胞基因編輯

使用Cas9/gRNA敲除內源性T細胞受體（TCR）并敲入表達第二代CAR構建體的雙鏈線性DNA。使用Invitrogen™ Neon™電轉染系統（100 μL），或在CTS Xenon大規模電轉染儀器上使用Xenon SingleShot電轉染腔室（1 mL）或Xenon MultiShot電轉染套件（18 mL）轉染5×10?個細胞/mL，并設置未轉染組。轉染3天后，通過流式細胞術分析評估CAR T細胞上的CD19基因表達。使用細胞計數儀和Gibco臺盼藍染色評估細胞活性。

圖3 對三個來源于白細胞單采術的T細胞供體進行CAR T細胞電轉染分析

2. Gibco™ CTS™ Xenon™可實現高效NK細胞基因編輯

使用Cas9/gRNA敲除內源性B2M基因。使用Invitrogen™ Neon™電轉染系統（100 μL），或在CTS Xenon大規模電轉染儀器上使用Xenon SingleShot電轉染腔室（1 mL）5×10?個細胞/mL。轉染3天后，通過流式細胞術分析評估NK細胞陽性率（中間列）及B2M基因敲除效率（左邊2列）。使用細胞計數儀和Gibco臺盼藍染色評估細胞活性（右列）。

圖4 三個來源于白細胞單采術的NK細胞使用CTS NK-Xpander培養基培養6天后，計數并進行NK細胞電轉染分析

3. Gibco™ CTS™ Xenon™可助力大規模HSC (CD34+ T)細胞的基因改造

在電穿孔后的細胞培養過程中，不同系統間細胞活力相當 (A)， 基因編輯效率也都維持比較高的水平，CTS Xenon 1ml SS平均編輯效率為82%±9，Multi-shot平均為75%±8 / 5ml，Neon 100 μL平均基因編輯效率為81%±7(B)。

圖5 分別使用Neon 100 μL系統和Xenon 1ml SS及5-25ml MS系統電轉HSCs細胞，評價Neon到Xenon的可擴展性

Xenon系統可提供多款電轉染緩沖液。CTS Xenon 電轉緩沖液（EP buffer）、基因組編輯緩沖液（GE buffer）和低電導率電轉緩沖液（LC buffer)，專為與CTS Xenon 系統配合使用而設計，可提供100 mL 瓶裝和袋裝形式，便于工藝開發和封閉式系統生產規模擴大。

Gibco CTS Rotea逆流離心系統

為了滿足細胞治療生產工藝往自動化封閉式的生產需求，我們開發出成熟工藝，利用CTS Rotea逆流離心系統靈活、溫和、輸出體積可低至5ml的特點，實現電轉前細胞電轉液的小體積、高密度、封閉式置換，輸出密度可高達5E8細胞/ml，回收率>80%，活率> 90%。

圖6 Rotea與Xenon物理連接：利用Rotea將待電轉細胞進行洗滌并置換成電轉液，然后通過管路無菌熱接接至Xenon multishot管路中，將需電轉的細胞以及payload泵至Xenon電轉儀，實現全封閉的電轉流程。

Rotea可做到高精準度、低體積輸出并維持高細胞活率和高回收率的儀器，我們也經過內部和客戶多方測試，發現經CTS Rotea逆流離心系統洗滌濃縮置換電轉液的樣品，后續基因編輯效率與細胞活率都與手工離心置換電轉液組相當。

圖7  單采血分離PBMC后，使用dynabeads 一步法分離與激活T細胞。2天后，分別用Rotea和手工離心對激活的T細胞進行洗滌和電轉液置換，隨即進行電轉，電轉分別采用Neon小電轉和CTS Xenon大規模電轉進行測試。圖中上部分為基因編輯效率，在電轉3天后，3個不同的donor中，Rotea組和手工離心組的基因編輯效率都是相當的，Xenon在21%-36%，Neon為10%-15%。圖下半部分展示了對應各組細胞活率，均維持在90%左右。

總結

基于在非病毒細胞改造技術方面的多年經驗積累，在結合如CTS Dynabeads、OpTmizer™ Pro，NK-Xpander培養基等高品質的原材料和Attune流式在線分析和qPCR等質控分析方案基礎上，賽默飛全新推出如CTS Xenon大規模電轉儀、CTS Rotea逆流離心細胞處理系統以及DynaCellect新一代自動化磁珠分選平臺，通過各儀器的物理連接及Cellmation數字化整合軟件，賽默飛打造了封閉式、模塊化和自動化非病毒細胞治療生產解決方案。這一套可擴展性生產解決方案，可幫助大家實現不同類型細胞療法的降本增效及國際化工藝生產的需求。

圖8 賽默飛非病毒細胞治療生產解決方案概覽

此外，賽默飛基于CTS Rotea和CTS Xenon構建了封閉式整合平臺，并實現了CAR T細胞的高效生產。基于CTS 儀器的模塊化特性，加上其數字化和物理整合能力，可靈活配置滿足多樣化生產需求。掃描下方二維碼獲取“采用封閉式集成式儀器工作流程，高效生產 CAR T 細胞"原文。