在細胞生物學研究中，對細胞膜進行熒光標記和示蹤是觀察細胞行為、分析細胞相互作用以及研究細胞遷移和分布的重要手段。DiI (DiIC18(3))作為一種親脂性膜染料，憑借其染色機制和優(yōu)異的性能，成為細胞膜標記領域的理想選擇。

一、DiI 的染色機制與特性

DiI 是一種親脂性膜染料，其核心結構賦予了它一定的染色特性。DiI 在進入細胞膜之前熒光非常弱，僅當進入到細胞膜后才可以被激發(fā)出很強的熒光。這種熒光增強效應歸因于 DiI 分子與細胞膜脂質雙層的相互作用。DiI 分子具有疏水性，能夠自發(fā)地插入到細胞膜的脂質雙層中，并沿著膜平面進行側向擴散。隨著 DiI 分子在細胞膜中的逐漸擴散，整個細胞膜會被均勻染色，發(fā)出明亮的熒光。

DiI 的熒光信號穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響，這使得它在長時間的觀察和檢測中表現(xiàn)出色。此外，DiI 對細胞的毒性極低，通常不會影響細胞的正常生理功能和生存力，適用于活細胞的長期示蹤和觀察。

二、DiI 的細胞膜染色與示蹤應用

細胞膜標記

DiI 最常見的應用是對細胞膜進行標記，以觀察細胞的形態(tài)和行為。在細胞標記實驗中，將細胞與 DiI 染色液混合孵育，DiI 分子會迅速插入到細胞膜中并發(fā)出熒光。通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到細胞膜的輪廓和形態(tài)變化。

DiI 標記的細胞膜熒光信號均勻且穩(wěn)定，能夠長時間保持熒光強度，適用于多種細胞類型，包括貼壁細胞和懸浮細胞。標記后的細胞可以用于后續(xù)的細胞培養(yǎng)、細胞遷移實驗和細胞相互作用研究等。

細胞示蹤

DiI 被廣泛用于細胞示蹤實驗，特別是在神經科學領域。它可以作為正向或逆向的示蹤劑，用于標記和追蹤神經元及其突起。在神經組織切片或活體動物模型中，DiI 標記的神經元可以通過熒光成像技術進行長期觀察，揭示神經元的連接模式、信號傳導路徑以及神經網絡的動態(tài)變化。

此外，DiI 還可以用于標記和追蹤其他類型的細胞，如免疫細胞、干細胞和腫瘤細胞等。在體內實驗中，DiI 標記的細胞可以通過熒光成像技術實時觀察其在生物體內的分布、遷移和存活情況，為細胞治療、組織工程和腫瘤轉移等研究提供重要數據支持。

三、DiI 的操作使用方法

染色前準備

在進行 DiI 染色之前，需要準備好細胞樣本。對于貼壁細胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細胞，然后用適當的緩沖液洗滌細胞，去除殘留的培養(yǎng)基成分。對于懸浮細胞，直接收集細胞并進行洗滌。將細胞調整到合適的濃度，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續(xù)的染色和檢測。

染色過程

將準備好的細胞與 DiI 染色液混合，DiI 的常用工作濃度為 5 - 20 μM。將混合后的細胞懸液置于 37℃、5% CO? 的細胞培養(yǎng)箱中孵育 5 - 30 分鐘。在孵育過程中，DiI 分子會插入到細胞膜中，產生熒光信號。孵育時間可根據細胞類型和實驗需求進行優(yōu)化，以獲得最佳的染色效果。

染色后處理

孵育完成后，用PBS輕輕洗滌細胞兩次，去除未結合的染料。對于需要進行細胞膜標記觀察的樣本，將標記后的細胞接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入適量的培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。對于需要進行細胞示蹤實驗的樣本，將標記后的細胞用于后續(xù)的體內或體外實驗。使用熒光顯微鏡進行觀察時，設置 549 nm 的激發(fā)波長和 565 nm 左右的發(fā)射波長檢測通道，收集紅色熒光信號，實現(xiàn)對細胞膜的標記和示蹤。

四、DiI 的應用案例與研究成果

DiI 已被廣泛應用于多種研究領域。在神經科學中，DiI 用于標記和追蹤神經元及其突起，揭示神經網絡的連接模式和信號傳導路徑。在細胞遷移研究中，DiI 標記的細胞被用于觀察細胞在 wound healing 實驗和 transwell 實驗中的遷移能力，為研究細胞運動機制和腫瘤轉移提供了重要數據支持。

在細胞相互作用研究中，DiI 與熒光共振能量轉移技術結合，用于研究細胞間的信號傳遞和分子相互作用。在細胞治療研究中，DiI 標記的干細胞被移植到宿主體內，通過熒光成像技術觀察干細胞的分布和分化情況，為干細胞治療的臨床應用提供了重要的實驗依據。