細胞侵襲的生物學意義與應用領域

細胞侵襲是指細胞受到外來信號刺激后，侵入周圍組織或基質的特性。這一過程在傷口愈合、細胞分化、胚胎發育和腫瘤轉移等生理與病理過程中發揮著至關重要的作用。深入研究細胞侵襲機制對于理解腫瘤惡性進展、開發抗腫瘤轉移療法以及探索胚胎發育和組織修復的分子基礎具有極其重要的意義。

試劑盒原理與優勢

細胞侵襲分析試劑盒（24 孔板，8μM）基于 Boyden 小室原理，并在微孔膜上添加了一層基質膠，以模擬細胞外基質環境。細胞在趨化因子或物理信號的誘導下，需降解并穿過這層基質膠，才能穿過微孔膜，從而實現對細胞侵襲能力的檢測。24 孔板設計允許同時進行多組實驗對比，8μm 孔徑的微孔膜適合大多數貼壁細胞和部分懸浮細胞的侵襲實驗。

與傳統的侵襲檢測方法相比，本試劑盒具有以下顯著優勢：一是結果更加客觀準確，避免了人工劃痕等操作帶來的誤差；二是操作簡便，實驗周期相對較短，通常在 24 - 72 小時內即可獲得結果；三是可重復性強，便于不同實驗室之間進行數據對比和驗證。

操作步驟詳解

細胞準備

1. 細胞選擇與培養 ：根據研究目的選擇合適的細胞系，特別是具有侵襲特性的腫瘤細胞系。確保細胞處于良好的生長狀態，無微生物污染，生長至對數生長期。將細胞培養在相應的培養基中，定期更換培養液，以保證細胞的活力和正常代謝。

2. 細胞計數與調整濃度 ：使用細胞計數板或自動細胞計數儀精確計數細胞，調整細胞濃度至適宜范圍，一般為

   $1 \times 10^5$

   -

   $2 \times 10^5$

   個 / mL。細胞濃度過高可能導致微孔膜上細胞過度重疊，影響侵襲結果的準確性；濃度過低則可能導致侵襲細胞數量過少，難以準確計數。

24 孔板與微孔膜準備

1. 24 孔板檢查 ：仔細檢查 24 孔板，確保孔內無異物、劃痕或破損。將孔板置于超凈工作臺中，進行紫外線消毒 20 - 30 分鐘，以消除可能存在的微生物污染，保證實驗環境的潔凈。

2. 基質膠鋪膜與微孔膜安裝 ：將適量的基質膠均勻鋪在 24 孔板的每個孔底，注意基質膠的用量要適中，確保能夠形成均勻的基質膠層。然后將 8μm 孔徑的微孔膜 carefully 放入鋪有基質膠的 24 孔板中，確保微孔膜平整且與孔壁緊密貼合。避免微孔膜出現褶皺或氣泡，否則可能影響細胞侵襲和后續的染色觀察。將鋪好微孔膜的 24 孔板在 37℃下孵育 1 - 2 小時，使基質膠固化，形成穩定的基質層。

細胞接種與侵襲誘導

1. 細胞懸浮與接種 ：將準備好的細胞懸液輕輕吹打均勻，確保細胞分散良好。然后將細胞懸液緩慢加入到含有微孔膜和基質膠的 24 孔板中，每孔加入適量的細胞懸液，一般為 100 - 200μL。避免產生氣泡，以免影響細胞在微孔膜上的附著和侵襲。

2. 設置對照組與實驗組 ：根據實驗設計，設置不同的實驗組和對照組。實驗組可加入趨化因子、藥物處理劑等刺激物，以誘導細胞侵襲；對照組則加入等量的無刺激物的培養基或溶劑。同時設置重復孔，一般每組設置 3 - 5 個重復孔，以提高實驗結果的可靠性。

3. 細胞侵襲孵育 ：將接種好細胞的 24 孔板置于 37℃、5% CO? 的細胞培養箱中孵育。孵育時間根據細胞類型和侵襲速度而定，一般為 24 - 72 小時。定期觀察細胞的侵襲情況，可通過倒置顯微鏡觀察細胞在微孔膜上的生長狀態和侵襲趨勢，判斷細胞是否開始穿過基質膠層和微孔膜。

染色與固定

1. 非侵襲細胞去除 ：孵育結束后，輕輕吸去 24 孔板中上層的培養液，用無菌的 PBS 洗滌微孔膜表面 2 - 3 次，去除未侵襲的細胞和殘留的培養液。注意 PBS 的量不宜過多，以免對微孔膜上的侵襲細胞造成沖擊，導致細胞脫落。

2. 染色與固定 ：將固定的染色溶液加入到 24 孔板中，使染色溶液覆蓋微孔膜。根據試劑盒說明書，選擇適當的染色方法和染色時間。常見的染色方法包括結晶紫染色、吉姆薩染色等，染色時間一般為 10 - 30 分鐘。染色完成后，用 PBS 洗滌微孔膜 2 - 3 次，去除多余的染色液，確保背景清晰，便于后續觀察和計數。

結果觀察與分析

顯微鏡觀察與拍照

1. 顯微鏡選擇與設置 ：使用普通光學顯微鏡或倒置顯微鏡進行觀察。選擇合適的物鏡倍數，如 10× 或 20×，以便清晰觀察微孔膜下表面的侵襲細胞。調整光強和焦距，確保圖像對比度適中，便于區分細胞和背景，準確識別侵襲細胞的形態和位置。

2. 拍照與記錄 ：在每個微孔膜下表面隨機選取多個視野，拍攝細胞圖像。記錄每個視野的細胞數量和分布情況。為了保證結果的代表性，需隨機選取至少 5 個視野進行拍照，避免主觀偏倚。可使用圖像分析軟件對細胞數量進行初步統計，確保數據的準確性。

定量分析

1. 細胞計數與數據統計 ：使用圖像分析軟件對拍攝的圖像進行定量分析。通過設置閾值和參數，自動識別并計數微孔膜下表面的侵襲細胞數量。計算每個孔的平均細胞數量，并求出每組的平均值和標準差，以評估細胞侵襲能力的差異。

2. 結果比較與統計學分析 ：將實驗組和對照組的細胞侵襲數量進行比較，分析不同處理條件對細胞侵襲能力的影響。采用適當的統計學方法，如 t 檢驗或方差分析，評估實驗結果的顯著性。繪制柱狀圖或折線圖，直觀展示細胞侵襲能力的變化情況，便于觀察和比較不同實驗組之間的差異。

實驗質量控制要點

• 細胞狀態監測 ：確保細胞在實驗過程中處于良好的狀態，避免細胞過度生長、死亡或污染。在細胞接種前，檢測細胞的活力和增殖能力，確保細胞能夠正常侵襲。定期觀察細胞的形態變化，及時發現異常情況，排除因細胞自身問題導致的實驗誤差。

• 實驗條件優化 ：根據細胞類型和實驗目的，優化實驗條件，如細胞濃度、孵育時間、趨化因子濃度等。進行預實驗，確定最佳的實驗條件，以獲得清晰、可靠的侵襲結果。同時，保持實驗環境的穩定，如溫度、濕度、CO? 濃度等，減少環境因素對實驗結果的影響。

• 基質膠質量與處理 ：基質膠的質量和處理對實驗結果至關重要。確保基質膠的新鮮度和純度，避免基質膠過期、降解或污染。在鋪膜過程中，嚴格控制基質膠的用量和均勻性，確保每個孔的基質膠層厚度一致。孵育固化基質膠的時間和溫度要精確控制，以形成穩定的基質層，為細胞侵襲提供良好的模擬環境。

• 試劑質量保障 ：使用高質量的試劑和耗材，確保試劑的純度和有效性。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，避免試劑過期、污染或誤操作。對關鍵試劑進行小規模測試，驗證其性能和穩定性，確保試劑能夠滿足實驗要求。

• 操作規范性 ：在實驗過程中，遵循嚴格的操作規范，避免人為誤差。使用移液器等工具時，確保精確吸取和加入液體，避免氣泡產生。在細胞接種、染色、洗滌等步驟中，保持動作輕柔、均勻，防止對細胞和微孔膜造成損傷。同時，做好實驗記錄，詳細記錄實驗過程中的各種參數和操作細節，以便后續結果分析和問題排查。