線粒體通透性轉換孔 (MPTP) 的生理功能與激活機制

線粒體通透性轉換孔（MPTP）是線粒體內外膜之間的非選擇性高導電性通道，由多種蛋白質復合組成。在正常生理狀態下，線粒體內膜可維持正常的線粒體電位梯度，以保證細胞呼吸作用及能量供應。隨著Ca2?的攝入和釋放，一種低電導滲透性轉換孔在張開和閉合中來回切換，參與調節線粒體的正常生理功能。

然而，當細胞發生凋亡或病理性死亡時，MPTP 的通透性發生顯著改變。Ca2?過載、線粒體谷胱甘肽的氧化、活性氧水平升高以及細胞色素C的釋放等因素均會導致MPTP的激活。一旦MPTP被激活，線粒體膜電位會迅速下降，線粒體內的細胞色素C等促凋亡因子釋放到細胞質中，觸發細胞凋亡的級聯反應。

試劑盒檢測原理

MPTP 檢測試劑盒基于熒光探針檢測技術，通過特異性熒光探針與MPTP 的結合來檢測其開放狀態。在正常情況下，熒光探針主要分布在線粒體外，熒光信號較弱；當MPTP開放時，熒光探針進入線粒體基質，與特定的靶標結合，產生明亮的熒光信號。通過熒光強度的變化，可以直觀地反映MPTP的開放程度，從而實現對細胞凋亡過程中MPTP激活的動態監測。

操作步驟詳解

細胞培養與處理

• 細胞類型選擇與培養 ：根據研究目的選擇合適的細胞類型，如哺乳動物細胞、腫瘤細胞等。將細胞接種于合適的培養容器中，如6孔板或培養皿，加入適量的培養基，置入37℃、5% CO?的細胞培養箱中培養，待細胞生長至對數生長期后進行后續實驗。

• 凋亡誘導處理 ：根據實驗設計，采用適當的凋亡誘導因素處理細胞，如化學誘導劑（阿霉素等）、輻射、氧化應激等。處理時間根據細胞類型和誘導因素的強度而定，一般為數小時至數十小時不等。同時設置未處理的對照組，以比較處理組和對照組之間MPTP的激活情況。

染色反應

• 細胞收集與洗滌 ：處理結束后，收集細胞，對于貼壁細胞，用胰酶消化后收集；對于懸浮細胞，直接離心收集。用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞2 - 3次，去除殘留的培養基和血清成分，確保細胞表面清潔，避免影響熒光探針的結合。

• 染色溶液配制 ：根據試劑盒說明書，將熒光探針溶解于適當的緩沖液中，配制成適當濃度的染色工作液。一般染色工作液的濃度和孵育時間需根據細胞類型和實驗需求進行優化，以確保熒光信號的特異性和強度。

• 細胞染色孵育 ：將收集好的細胞懸浮于染色工作液中，輕輕混勻，使細胞與熒光探針充分接觸。然后將細胞置于37℃、5% CO?的孵箱中孵育15 - 30分鐘。孵育過程中可每隔幾分鐘輕柔搖晃細胞，確保染色均勻。

熒光檢測

• 熒光顯微鏡觀察 ：將染色后的細胞滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，避免細胞干燥。在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光信號，使用適當激發波長的光源激發熒光探針。通常，熒光探針的激發波長和發射波長根據具體探針的特性而定。正常情況下，細胞熒光信號較弱；而當MPTP開放時，熒光信號明顯增強。通過觀察細胞的熒光強度變化，可以直觀地判斷MPTP的激活狀態。

• 流式細胞儀檢測 ：將染色后的細胞用PBS洗滌1 - 2次，去除未結合的熒光探針，調整細胞濃度至適當范圍（一般為1×10^5^-1×10^6^個/mL）。使用流式細胞儀進行檢測，設置適當的激發波長和檢測波長，根據熒光強度的變化分析細胞群體中MPTP的激活情況。通過分析熒光強度的分布，可以計算MPTP開放的細胞比例，從而實現對細胞凋亡程度的定量評估。

實驗質量控制要點

• 細胞狀態監測 ：確保細胞在實驗過程中處于良好的狀態，避免細胞過度生長、污染或死亡。定期監測細胞的生長曲線和存活率，確保實驗結果的可靠性。

• 染色條件優化 ：根據細胞類型和實驗需求，優化熒光探針的濃度和孵育時間，以獲得最佳的熒光信號。同時，設置適當的對照組，如未處理組、陽性對照組（已知誘導MPTP開放的處理組）和陰性對照組（阻斷MPTP開放的處理組），以驗證實驗結果的準確性和特異性。

• 儀器校準與設置 ：在熒光顯微鏡和流式細胞儀使用前，進行儀器校準和設置，確保激發波長、檢測波長、靈敏度等參數的準確性。定期維護和校準儀器，避免因儀器性能波動導致實驗結果的偏差。