【概述】

       肼是一種無色發(fā)煙的、具有腐蝕性和強(qiáng)還原性的液體化合物，它是比氨弱的堿，通常由水合肼脫水制得。它常用作制藥原料，如合成氨基尿、異yan肼、呋喃西林鹽酸阿齊利特，硫酸阿米卡星和他唑巴坦酸等，同時(shí)在肼還常用于生產(chǎn)多種農(nóng)藥，如植物生長調(diào)節(jié)劑，落葉劑及除草劑等。肼可對肝、肼可對肝、腎、血液等系統(tǒng)產(chǎn)生毒副作用。有數(shù)據(jù)顯示，肼可能具有致癌作用。因此，要求藥品中肼的殘留量越來越低，如何快速、簡便、高靈敏地監(jiān)測生產(chǎn)過程中肼的殘留量，一直是藥物溶劑殘留檢測研究的一個問題。

       目前水合肼的的氣相色譜法一般采用直接和衍生化法。直接法是采用熱導(dǎo)檢測器分析，但其靈敏度低，另外水合肼是強(qiáng)堿性化合物，對柱子要求較高。衍生化法一般采用2，4．二硝基苯j(luò)ia醛或乙酰丙酮來進(jìn)行，此方法需要加額外的衍生化試劑。JamesR．Holtzelaw采用丙酮作為衍生化試劑，對空氣中存在的肼類化合物(肼、甲ji肼、偏二甲肼)進(jìn)行了分析，收到了良好的效果。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

表1.儀器參數(shù)設(shè)置

【樣品提取】

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

本文用丙酮乙酸作為衍生化試劑，采用頂空進(jìn)樣及液體直接進(jìn)樣法結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜法藥品中水合肼進(jìn)行了分析，另外本文采用Time-SIM方式定量，靈敏度高，選擇性好，樣品前處理簡單。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

1.頂空條件的選擇

水合肼一種無色發(fā)煙的、具有腐蝕性和強(qiáng)還原性的液體化合物，它是比氨弱的堿，其沸點(diǎn)為118.5℃，因其在100℃左右分解成N2、NH3和H2，因此常采用衍生后對其進(jìn)行分析，如下圖1、2為肼及其衍生后（乙酸丙酮（1 : 10））的產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖1.水合肼的質(zhì)譜圖

圖2.水合肼衍后產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

       水合肼衍生產(chǎn)物為堿性，且衍生產(chǎn)物沸點(diǎn)在110℃，易溶于水，因此該物質(zhì)易采用液體直接進(jìn)樣進(jìn)行分析，但考慮到有些藥品不易溶于有機(jī)溶劑且極易溶于水，本方法采用頂空法及液體直接進(jìn)樣法分析。由于該衍生產(chǎn)物的強(qiáng)堿性，采用頂空法時(shí)在其中加入50μL 50% NaOH水溶液，可有效的提高靈敏度，同時(shí)采用頂空分析干擾物質(zhì)減少。

       本實(shí)驗(yàn)選取飽和氯化鈉水溶液做溶劑，可將待分析藥品*溶解，溶劑中含大量有機(jī)溶劑因此頂空溫度不易過高，同時(shí)隨著樣品平衡溫度的升高，進(jìn)入氣相的有機(jī)物的量增加，從而可以提高分析的靈敏度，由于實(shí)驗(yàn)中采用水溶，孵化溫度不易過高，本實(shí)驗(yàn)中主要考察了60℃、70℃、80℃、90℃的平衡溫度對靈敏度的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明選擇平衡溫度90℃時(shí)目標(biāo)化合物的靈敏度大，更適宜分析。實(shí)驗(yàn)中傳輸線溫度選擇130℃以保證沒有水氣帶入色譜柱，影響分析效果。

       當(dāng)孵化時(shí)間增長分析物在水相和氣相兩相中的分配系數(shù)越小，當(dāng)孵化時(shí)間達(dá)到一定時(shí)間分析物在兩相間達(dá)到大的分配，此時(shí)為分析時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)中考察了5 min，10min，15 min，20 min，30 min，對孵化效率的影響，實(shí)驗(yàn)終結(jié)果表明，當(dāng)孵化時(shí)間為15 min時(shí)效率高，隨后靈敏度達(dá)到大值，鑒于提高分析效率考慮，終選擇孵化時(shí)間15min。如下圖3為不同孵化時(shí)間下孵化效率的比較圖。

圖3.不同孵化時(shí)間下孵化效率，其中y為丙酮連氮的響應(yīng)值

2.色譜柱的選擇

       已有文獻(xiàn)報(bào)道水合肼的分析，采用-17及624色譜柱分析.本方法采用乙酸丙酮（1 : 10）衍生法將水合肼衍生為丙酮連氮。對于不同的藥品，有些藥品為水溶性的，此時(shí)可采用頂空法分析，另外有些藥品為非水溶性的，此時(shí)可采用有機(jī)溶劑直接溶解分析。同時(shí)采用頂空法分析可以減少儀器的污染，由于水合肼衍生產(chǎn)物沸點(diǎn)較高，頂空法未顯出明顯的靈敏度優(yōu)勢。無論哪種方法通常都需要將水合肼衍生，衍生后產(chǎn)物丙酮連氮為堿性、極性物質(zhì)，本方法考察了Tg-17 30 m×0.25μm×0.25 mm和Tg-Wax 30 m×0.25μm×0.25 mm，Tg-5 amine 30 m×0.25μm×0.25 mm,Tg-Wax B 30 m×0.25μm×0.25 mm四種不同類型色譜柱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選1701及wax色譜柱時(shí)，由于衍生產(chǎn)物顯堿性，色譜峰有明顯的托尾，見下圖4。當(dāng)分析目標(biāo)化合物為堿性時(shí)，此時(shí)宜選擇堿性化處理的色譜柱。由于目標(biāo)物為極性化合物，因此本方法終選擇分析色譜柱為Tg-Wax B 30 m×0.25μm×0.25 mm，色譜峰形得到明顯改善，靈敏度明顯提高，同時(shí)進(jìn)樣一段時(shí)間后，色譜柱無流失。

3.標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品加標(biāo)色譜圖

水合肼為藥物生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，本方法采用不同的方法分析水合肼，如下圖5-6分別為液體及頂空進(jìn)樣方式水合肼的TIC譜圖，由此圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用頂空進(jìn)樣時(shí)干擾更少且靈敏度較好。本法采用T-SIM方式定量，如圖7為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)T-SIM譜圖及空白樣品加標(biāo)色譜圖，其中下圖為樣品加標(biāo)色譜圖。

圖4. 0.5μg/mL水合肼衍生后在不同類型色譜柱上的分離情況

圖5.液體進(jìn)樣方式—2.0μg/mL水合肼衍生后TIC色譜圖

圖6.頂空進(jìn)樣方式—2.0μg/mL水合肼衍生后TIC色譜圖

圖7.標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加標(biāo)水合肼的T-SIM色譜圖

4.線性、檢出限及RSD

頂空法：

       配制濃度分別為：0.01、0.02、0.04、0.1、0.2μg/mL的校準(zhǔn)溶液，采用上述液體進(jìn)樣方法進(jìn)樣分析，考察各組分在0.01-0.2μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該衍生物在0.01-0.2μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)0.9956，見下圖8。

       對某樣品添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（加標(biāo)濃度為5.0μg/g、50μg/g），考察的加標(biāo)回收情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加標(biāo)回收率為82.0-93.0%之間，符合日常分析檢測的要求。對5.0、50μg/g加標(biāo)水平平行測定6次，平均RSD值在4.8-8.3%，符合穩(wěn)定性要求。同時(shí)以三倍信噪比計(jì)算水合肼的檢出限，測得儀器檢出限在0.01μg/mL。

圖8.為水合肼的液體進(jìn)樣方式線性

液體直接進(jìn)樣法：

配制濃度分別為：0.02、0.04、0.2、0.4、2.0、4.0μg/mL的校準(zhǔn)溶液，采用上述方法分別進(jìn)樣分析，考察各組分在0.02-4.0μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該衍生物在0.02-4.0μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，見下圖。

對某樣品添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（加標(biāo)濃度為2.0μg/g、40μg/g），考察的加標(biāo)回收情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加標(biāo)回收率為78.0-88.0%之間，符合日常分析檢測的要求。對2.0、40μg/g加標(biāo)水平平行測定6次，平均RSD值在4.9-9.3%，符合穩(wěn)定性要求。同時(shí)以三倍信噪比計(jì)算水合肼的檢出限，測得儀器檢出限在0.02μg/mL。

圖9.為水合肼的頂空進(jìn)樣方式線性

實(shí)際樣品測試結(jié)果

采用如下頂空進(jìn)樣法條件測定了幾個市售藥品，其中某藥品中檢測出含有該成份水合肼，測試譜圖如下，含量為37.5μg/g。如下表為測定三個樣品結(jié)果。

表1.未知樣品測試結(jié)果

圖10.圖為某測出水合肼未知樣品TIC色譜圖

圖11.左圖為某樣品在4.37min處的質(zhì)譜圖，其中右圖為NIST譜庫中水合肼的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用賽默飛世爾科技Triplus 300頂空自動進(jìn)樣器結(jié)合1310GC配ISQ質(zhì)譜檢測器分析藥品中的水合肼，樣品通過衍生法分別采用頂空進(jìn)樣方式及液體直接進(jìn)樣方式，方法準(zhǔn)確，靈敏度高，滿足檢測要求。