5分鐘拉近你與科學前沿的距離，一起來了解“FAMIN蛋白對嘌呤核苷酸代謝的影響”

由LACC1編碼的FAMIN（Fatty Acid Metabolism-Immunity Nexus）是一種和許多疾病相關的蛋白，高外顯率突變，如C284R或I254V，可導致幼年特發性關節炎（JIA），成人Still綜合癥，麻風病或早發炎癥性腸病等。小鼠的基因敲除實驗結果也顯示FAMIN活性降低會加重敗血癥和關節炎的程度，另有研究顯示FAMIN會對線粒體功能的正常發揮和巨噬細胞的氧化磷酸化及糖酵解都產生影響。

英國阿登布魯克醫院和劍橋大學在相關方面做了一個多組學結合的實驗并將結果總結發表在Cell雜志上，旨在研究FAMIN作為一個多功能嘌呤核苷酸代謝酶的作用，實驗從不同角度，利用不同平臺研究了嘌呤核苷酸的代謝及其對線粒體功能的影響。

圖：嘌呤核苷酸代謝通路

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現就代謝組學的部分進行詳細介紹：

首先 …

將HepG2細胞進行FAMIN siRNA轉染，并對細胞數目和耗氧量等指標進行監測，發現在FAMINyi制后，細胞增殖減少，糖酵解和氧化磷酸化的速度都有不同程度的下降。將FAMINyi制的 HepG2細胞分別和10ug重組人FAMIN254I或等量蛋白緩沖液（空白對照）在37℃的PBS中孵育1hr，將樣本中的小分子代謝物用甲醇提取并進行LCMS分析，得到超過25,000個特征峰。

圖：正離子和負離子模式下檢測到的離子m/z和豐度

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LCMS實驗在Vanquish+Q Exactive Plus液質聯用平臺上進行，對于極性較高的水相代謝物，采用HILIC色譜柱進行液相分離，Orbitrap質譜的分辨率設置為70,000，wan美分辨復雜的體系，同時高質量精度的數據確保在化學式匹配和化合物檢索的時候得到準確結果，zui大程度上減少了假陽性或假陰性情況的發生。

對比FAMIN254I孵育的樣本和空白對照，發現FAMIN254I孵育的提取物中3個特征峰有明顯降低，4個升高，就像下面這張火山圖展示的一樣。

確定這7個生物標志物的步驟如下：

在鑒定的過程中，首先需要確定生物標志物的化學式，對于Orbitrap的數據來講，這一步是通過精確質荷比和同位素精細結構結合來完成的（質量偏差不超過2ppm）；

然后將化學式同二級質譜信息結合，進行數據庫的檢索，得到化合物的結構信息，下圖以adenosine為例，上半部分是實測數據中的二級質譜圖，下半部分是mzCloud數據庫里的信息，二者以鏡像圖的形式展示，清楚地體現了實測數據和數據庫信息的匹配程度，并將匹配到的碎片結構進行標注。

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此處檢索的數據庫為mzCloud（https://www.mzcloud。。ｏｒｇ/），mzCloud是規模龐大、信息豐富的高分辨譜圖庫，現包含超過18,500個化合物，并且這個數量還在不停增加，譜圖的數量超過725萬張，包括不同碎裂方式和碰撞能的信息，所有譜圖全部為標準品的實測數據，是化合物鑒定的重要支持。

圖：mzCloud界面展示

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對于如此龐大的特征峰數量和理化性質各異的代謝物，實驗者手動鑒定豈不是要做到頭禿，不要擔心，有強大的軟件幫助我們自動進行數據處理。這個軟件就是高分辨液質數據處理的利器——Compound Discoverer。

Compound Discoverer …

Compound Discoverer軟件可以完成從原始數據到zui終結果的全流程工作，包括特征峰提取和對齊、化學式預測、化合物結構鑒定、代謝通路分析，以及代謝組學常用的主成分分析（PCA）、偏小二乘方判別分析（PLS-DA）等，結果的呈現形式包括散點圖、火山圖、柱狀圖、箱式圖、熱圖等，如果這些還不能滿足你，別擔心，用戶還可以自編程將數據按照自己想要的方式展示或計算。

圖：Compound Discoverer結果展示示例（左→右：PCA散點圖、火山圖，S-plot，熱圖）

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本研究通過Compound Discoverer軟件的自動峰提取、對齊和鑒定，得到差異代謝物a-c分別是adenosine、inosine和guanosine，為了進一步驗證鑒定結果的準確性，將樣本中三個化合物的提取離子流圖同標準品進行比對，得到*一致的色譜保留行為，故確定幾個化合物鑒定的準確度，下圖展示了化合物a和b 分別同adenosine和inosine標準品數據匹配的情況。

同樣的過程，對含量相對升高的化合物d-g進行鑒定，得到結果分別為hypoxanthine，guanine，pentose-phosphate, xanthine。至于究竟是哪種pentose-phosphate，同樣采用同標準品的色譜峰比對的方法，并且采用TSQ Quantiva的SRM碎片比例來驗證，確定結果為R1P，如下圖。

差異代謝物a-c在兩組的峰面積在FAMIN254I組中有所降低，提示FAMIN可以分解胞內嘌呤核苷。

同時，化合物d-f在FAMIN254I存在的情況下含量有所升高（g的量太低，不做展示），提示FAMIN在幫助核堿基和R1P合成。

化合物a-c均隨重組FAMIN254I的劑量增加而峰面積降低，而其它核苷酸或核苷并未受FAMIN254I影響，提示FAMIN是作用于嘌呤核苷，將其生成對應的核堿基和R1P的酶。

在擬靶向代謝組學的工作中，三重四極桿和Orbitrap高分辨質譜相結合，可以提供豐富的數據覆蓋廣度和超高的定量能力，本研究中采用TSQ Quantiva和Q Exactive Plus相結合，定位到同FAMIN作用相關的代謝物及其通路。在今年的ASMS，賽默飛推出了新一代Orbitrap Exploris 240，自帶多種方法模板，同TSQ平臺輕松進行方法無縫轉換，操作簡便，結合AcquireX功能，助力擬靶向代謝組學實驗，將研究的覆蓋廣度和數據挖掘深度做到ji致，有興趣的老師請掃描以下二維碼獲得電子樣本。

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