前言： 多肽藥物是介于大分子蛋白/抗體類藥物和小分子藥物之間的一 類重要的藥物分子，因其生物活性高、靶向專一性高、選擇性 高、毒副作用低等優點而被廣泛應用于疾病治療領域[1]。Thermo Obitrap因其超高的分辨率，質量軸穩定性，已經廣泛應用 在了多肽藥物結構表征中。Obitrap 作為高分辯還具有*靈敏 度和線性范圍，因此也被越來越多的應用到藥物的定量研究中 [2,3]。

PTH 是甲狀旁腺主細胞分泌的由84個氨基酸組成的多肽類 激素，其對于維持鈣磷代謝的穩定起著至關重要的作用。 特立帕肽（SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF，4117.7 Da）是一種人工重組合成的人PTH 1-34多 肽，是第yi個被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的抗骨質疏松性骨折的骨合成藥物 [3]。 Thermo Scientific Q Exactive Focus 四極桿 Orbitrap 組合型質 譜儀專為常規分析應用而設計，高分辨率為7萬，大分辨 率12Hz，可以在同一系統中同時實現準確可靠的定性和定量分 析。 Obitrap Fusion Lumos是賽默飛世爾科技在2015年推出的三合 一的靜電場軌道阱超高分辨質譜儀。Lumos搭載的分段式四級 桿技術（Advanced Quadrupole Technology，AQT）使離子傳 輸效率至少提高了 2 倍，超高場的Obitrap擁有50萬分辨率和 20Hz的超快掃描速度，使Lumos在具有的靈敏度同時，還 擁有穩定性和動態范圍。 本實驗將基于兩款Obitrap高分辯質譜Q Exactive Focus和Obitrap Fusion Lumos建立多肽藥物特立帕肽的定量分析方法，考 察高分辯質譜Obitrap的定量能力。

 實驗條件 樣品配置： 稱取特立帕肽粉末，加水稀釋成5mg/mL的標準品儲備液。用 含5%乙腈，0.1μg/μL BSA，1%甲酸的稀釋劑，逐級稀釋特立 帕肽標準品，配置成標準曲線。 色譜條件： 液相系統為：Thermo Vanquish Flex液相色譜儀，色譜柱為Thermo AccucoreTM 150 C18（50×2.1mm，2.6um，貨號16126-052130） ；柱溫：45℃；流動相及梯度系統程序見表1

血漿樣品前處理： 取150μL的人空白血漿，加入15μL的特立帕肽工作液，震蕩混 勻。按體積比1:6加入含75%乙腈，0.1% FA的沉淀劑后，充 分震蕩。6500g離心5min，取上清后，40℃揮干。揮干樣品 用150μL含10% ACN，90%水，1% FA的復溶劑復溶，充分震 蕩，14000g離心5min，取上清，上樣5μL進行分析。 數據分析： 所有數據分析均使用Thermo Scientific™ TraceFinder™ 軟件完 成。TraceFinder平臺包含了儀器控制，方法開發，數據定性定 量批處理等功能。提峰時質量偏差為±5ppm。 實驗結果 1、特立帕肽標準品在Focus，Lumos上的線性與準確度。 用稀釋劑（含0.1ug/μL BSA，1% FA，5% ACN）的稀釋劑逐級 稀釋特立帕肽標準品，配置成一系列濃度標準品，上樣分析。 結果表明，Focus對特立帕肽的定量下限為50 pg/mL（圖1）， 上樣5μL，上柱約60 amol，標準曲線線性良好，R2=0.997，標 準曲線各點回算的濃度在理論值的15%以內（表4）。

 特立帕肽的LOQ點在Focus和Lumos上的提峰圖如圖3，峰型良 好，信噪比S/N>10，重復5針的RSD<10%（表6），表現出了 良好的穩定性。 

 2、特立帕肽血漿樣品在Lumos上的線性與準確度。 同時在Lumos上考察了特例帕肽血漿樣品的定量下限。取150 μL的空白人血漿，加入一系列濃度梯度的特立帕肽標準品，配 置成血漿標曲，用1:6體積的75% 乙腈沉淀后，離心去上清， 揮干，復溶后進樣。 結果顯示，Lumos對于基質復雜的血漿樣品仍表現出良好的線 性，精密度，穩定性。特立帕肽低定量下限為50 pg/mL，線 性范圍50 pg/mL-50 ng/mL（圖4），1000倍的線性范圍，上柱 量約60 amol，標曲各點Diff值 < 10%（表7）。

 結論： 本文分別在Obitrap Focus賽默飛四極桿-軌道阱質譜儀，Lumos上建立了大分子多肽類藥物 特例帕肽的定量分析方法。結果表明，高分辯Obitrap對特立 帕肽表現出良好的定量能力，定量下限可以分別達到上柱60 amol，24 amol。同時，對于基質更為復雜的血漿樣品，Lumos 上可以達到定量下限上柱60 amol，靈敏度滿足臨床上對特立帕 肽的檢測要求。Obitrap作為高分辨質譜，在擁有超高分辨率的 同時，兼具出色的靈敏度和穩定性，可以應用大分子多肽類藥 物的定量分析與檢測。

參考文獻 [1] Lau J L, Dunn M K. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions[J]. Bioorganic & medicinal chemistry, 2018, 26(10): 2700-2707. [2] Dillen L, Cuyckens F. High-resolution MS: first choice for peptide quantification?[J]. Bioanalysis, 2013, 5(10): 1145-1148. [3] Kang L, Weng N, Jian W. LC–MS bioanalysis of intact proteins and peptides[J]. Biomedical Chromatography, 2019: e4633. [4] Quattrocchi E, Kourlas H. Teriparatide: a review[J]. Clinical therapeutics, 2004, 26(6): 841-854.