可比性研究|使用HR-MAM方法對原研藥與其生物類似藥進行可比性研究

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可比性研究

生物類似藥通常指與參考分子（原研藥）高度類似的治療性生物產品1。世界各地的監管機構，如美國食品藥品監督管理局(United States Food and Drug Administration, USFDA), 歐洲藥品管理局（European Medicines Agency, EMA）和中國市場監督管理總局（National Medical Products Administration, NMPA）均發布了指導規則，要求證實生物類似藥與原研藥之間在藥品安全性/功效性等方面的相似度1。

隨著高分辨質譜（HRAM MS）逐步成為創新藥和生物類似藥表征*的分析工具，在氨基酸序列確認和化學/翻譯后修飾等鑒定中，均起到*的作用2。2015年，Rogers 等2在公開發表的文獻中提及可將基于肽圖分析的Multi-Attribute Method (MAM) 工作流程用于多重PQA的監控與定量，與此同時還可進行新組分檢測（new peak detection）2，進而提供更多產品質量相關信息，并提高生產率。由此，MAM在質量控制（QC）實驗室中替代傳統分析手段的潛力，引起越來越多生物制藥行業和監管機構越來越多的關注2 3。2019年，US FDA的Rogstad等在發表的文獻中提及可以考慮使用MAM替代一些常規的QC分析方法4。

圖1 賽默飛HR-MAM工作流程

（點擊查看大圖）

本期我們介紹賽默飛HR-MAM (圖 1)工作流程的新進展：對未經處理/不同強制降解條件下的生物類似藥與利妥昔原研藥進行可比性研究，對多個選定PQA進行有效的鑒定、相對定量和監控，以減少分析實驗所花費的時間，并提高生產率。

多PQA選定

助力原研藥與生物類似藥結構相似性確證：

PQA通常在藥物安全性與有效性方面起到重要作用，基于肽圖分析表征可以選擇適合的PQA，如：糖基化（glycosylation），脫酰胺化（deamidation），琥珀酰亞胺化（succinimide formation），異構化（isomerization），氧化（oxidation），重鏈C-末端賴氨酸截斷（C-terminal lysine truncation），N-末端焦谷氨酸環化（N-terminal pyroglutamate）。

所有被選中的PQA可在BioPharma Finder軟件中創建為一個包含該PQA肽段保留時間/質荷比/價態/所有電荷態等信息的工作簿，隨后此工作簿被導入至變色龍軟件中，用于后續的MAM數據分析。使用HR-MAM工作流程，即使是含量約0.1%的組分，也可通過高分辨質譜平臺提供的數據獲得高重現性的定性與定量結果。在本文的研究中，選定了下列PQA來證實HR-MAM工作流程用于目標肽段定量的能力，

進而評估利妥昔原研藥與生物類似藥之間的結構相似性：

重鏈 N55 脫酰胺化和琥珀酰亞胺化;

重鏈 N388和N393 脫酰胺化;

重鏈 N388和N394 琥珀酰亞胺化;

重鏈 M256 氧化;

重鏈 D284 異構化;

重鏈N-糖基化;

重鏈C-末端賴氨酸截斷和輕/重鏈N-末端焦谷氨酸環化。

PQA相對定量

兼具穩健性與重現性，MAM展現*潛力：

由于C-末端賴氨酸截斷與N-末端焦谷氨酸環化等末端修飾會影響單克隆抗體產品的電荷異質性5，所以在結構可比性研究中需要對其進行評估。以本文中涉及的PQA為例，利妥昔原研藥和兩個不同批次的生物類似藥，其重鏈C-末端賴氨酸截斷與輕/重鏈N-末端焦谷氨酸環化的比率均在可比范圍內（圖2）。值得注意的是，所有定量結果三針技術重復的變異系數（coefficients of variation, CVs）均小于2%，顯示了優異的重現性。

圖2. 利妥昔原研藥/生物類似藥在未經強制降解/強制降解條件下常見末端修飾相對定量結果。圖中每個條柱均代表三針技術重復的平均值，誤差線代表三針技術重復的標準偏差（下同）。（點擊查看大圖）

N-糖基化可能會影響單克隆抗體產品的免疫原性、藥效、抗體依賴的細胞介導細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）、補體依賴的細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC）、血清清除率和藥代動力學5。在生物類似藥的開發和生產過程中，為了確保產品的安全性和有效性，N-糖基化必須被密切監控并嚴格控制。對于生物類似藥開發廠商而言，生物類似藥的糖基化異質性分布必須與其原研藥具有可比性，以避免擴大臨床試驗的規模。

在本方案涉及的實驗所用的原研藥和生物類似藥樣品中，總共鑒定到15種不同糖型，這些糖型的相對含量在不同樣品之間并沒有明顯區別（圖3）。與傳統N-糖鏈定量方法相比，未發生糖基化修飾的肽段相對含量也可在HR-MAM工作流程中同時被監控，這是傳統方法無法做到的，展現了其獨到價值。對所有糖型的相對定量結果同樣顯示了優異的重現性和靈敏度。例如，對于相對含量約0.3%的糖型A2S1G0F ，其技術重復之間的CV<5.5%。

圖3. 利妥昔原研藥/生物類似藥在未經強制降解條件下重鏈EEQYNSTYR 15種糖型相對定量結果（三針平行技術重復）。（點擊查看大圖）

對于其他選定PQA，借助于賽默飛高分辨質譜平臺的高靈敏度和高選擇性，結合Vanquish UHPLC系統和Accucore Vanquish C18 +色譜柱提供的高重現性分離，均可實現兼具穩健性與重現性兼具的相對定量。

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參考文獻：

[1] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015. 

[2] Liu, H., et al. A high-resolution accurate mass multi-attribute method for critical quality attribute monitoring and new peak detection. APPLICATION NOTE 72916. 

[3] Rogstad, S., et al. Multi-Attribute Method for Quality Control of Therapeutic Proteins. Anal. Chem. 2019, 91, 14170−14177.

[4] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015. 

[5] Beck, A., et.al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal. Chem. 2013, 85, 715−736.

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