新突破

新guan肺炎自2019年暴發(fā)以來，給全社會帶來了災(zāi)難性的影響，不僅對quan世界人民的健康造成了巨大威脅，還對全球經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了震蕩性的影響。因此，對新guan肺炎的研究也顯得愈發(fā)重要。近期，來自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部精準(zhǔn)醫(yī)療多組學(xué)研究中心的黃超蘭團(tuán)隊、中國科學(xué)院院士高福團(tuán)隊以及中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高峰團(tuán)隊，通過采用基于質(zhì)譜的糖基化修飾鑒定技術(shù)，對新guan肺炎顆粒上S蛋白的O-糖基化修飾圖譜進(jìn)行了整體描繪，進(jìn)而提出了“O-Follow-N”的O糖基化修飾規(guī)律，為新guan肺炎的致病機(jī)制探索提供了研究基礎(chǔ)。而這項出色的研究，也于2021年8月2日以“O-glycosylation pattern of the SARS-CoV-2 spike protein reveals an“O-Follow-N” rule”為題發(fā)表在了Cell Research期刊上。

糖基化修飾（Glycosylation）是蛋白質(zhì)主要的翻譯后修飾類型，其廣泛參與細(xì)胞黏附、識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要過程，影響蛋白質(zhì)的分泌、運(yùn)輸和穩(wěn)態(tài)調(diào)控，可發(fā)生在細(xì)胞50-70%的蛋白質(zhì)上，2021年糖基化修飾鑒定被Nature Methods評為zui值得關(guān)注的技術(shù)之一。

根據(jù)糖苷鏈類型，蛋白質(zhì)糖基化修飾可以分為四類：（1）N-連接糖基化；（2）O-連接糖基化；（3）C-連接糖基化；（4）糖基磷脂酰肌醇錨定。

其中O-糖基化修飾，是在高爾基體中產(chǎn)生。它在人體中有70余種常見糖型，無特定氨基酸結(jié)構(gòu)域。目前，對O-糖基化修飾研究存在許多困難，比如：

1、糖基化修飾的糖鏈形成無固定模版；

2、受200多種糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)雜調(diào)控；

3、糖基化肽段劑量水平低；

4、規(guī)模化糖鏈結(jié)構(gòu)解析通量低；

5、糖鏈構(gòu)成微不均一性，定性與定量困難；

6、功能性糖基化位點(diǎn)及關(guān)鍵糖結(jié)構(gòu)指認(rèn)困難。

受這些因素影響，對O-糖基化修飾的研究也是少之又少。現(xiàn)階段，對于大規(guī)模、高通量的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究，zuihao的途徑就是利用基于高分辨質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。在這篇報道中，黃教授等團(tuán)隊，就是通過基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，克服一系列困難，shou次對新guan病毒上S蛋白的O-糖基化進(jìn)行了綜合性描繪。

實驗中，研究者為獲得天然狀態(tài)下S蛋白的N-和O-糖基化修飾完整圖譜，首先從SARS-CoV-2病毒顆粒上獲得S蛋白，并使用了LysC+Trypsin, Chymotrypsin, GluC, Elastase 以及 alpha-Lytic等多種蛋白酶將S蛋白酶解成肽段。而對于這種復(fù)雜糖蛋白酶解后產(chǎn)生的肽段，普通質(zhì)譜很難進(jìn)行檢測。研究者則采用了具有超高分辨率的Orbitrap Eclipse 三合一質(zhì)譜儀，并利用三合一儀器多種碎裂功能中的階梯HCD（stepped collisional energy SCE），HCD（Higher-energy collisional dissociation）以及組合式的HCDpdEThcD三種碎裂方法進(jìn)行質(zhì)譜分析。

圖1. Orbitrap Eclipse 三合一質(zhì)譜儀

Orbitrap Eclipse三合一質(zhì)譜儀是一臺不僅擁有著CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多種碎裂模式的質(zhì)譜儀，而且還具有高達(dá)50萬的分辨率，能夠?qū)Χ喾N形式的修飾肽段進(jìn)行精準(zhǔn)定性與定量，為研究者提供了更堅實的硬件基礎(chǔ)。

研究中，研究者共鑒定到了39個糖基化修飾位點(diǎn)。其中包括此前已報道的22個N-糖基化修飾位點(diǎn)，以及17個O-糖基化修飾位點(diǎn)。值得注意的是，這17個O-糖基化修飾位點(diǎn)是shou次從SARS-CoV-2病毒顆粒中提取的S蛋白上鑒定到的。并且通過深入分析這些位點(diǎn)，研究者發(fā)現(xiàn)在這17個位點(diǎn)中，有11個位點(diǎn)位于糖基化的天冬酰胺（Asn, N）附近。為了更準(zhǔn)確的對這一現(xiàn)象進(jìn)行挖掘，研究者將NxS/T共有基序內(nèi)糖基化的N每一側(cè)的3個氨基酸定義為“N±1-3”。分析結(jié)果顯示，11個O-糖基化修飾位點(diǎn)分布在“N±1-3”的位置上，位點(diǎn)信息確定的位點(diǎn)有10個，其中7個位點(diǎn)分布在“N+2”的位置上。研究者還通過開展定點(diǎn)突變實驗進(jìn)一步證實N糖基化修飾的存在是“N±1-3”的位置上出現(xiàn)O-糖基化修飾的先決條件。基于以上分析，研究者提出SARS-CoV-2病毒S蛋白的糖基化修飾存在O-糖基化修飾追隨N-糖基化修飾發(fā)生的現(xiàn)象，并將這一現(xiàn)象命名為“O-Follow-N”規(guī)律。

圖2.新guan病毒S蛋白上符合“O-Follow-N”規(guī)律的O糖基化修飾

小結(jié)Summary

研究基于前沿的質(zhì)譜分析技術(shù)，通過使用超高分辨的三合一質(zhì)譜儀Orbitrap Eclipse，揭示了新guan病毒上S蛋白的O糖基化修飾譜，進(jìn)而提出了O 糖基化修飾的“O-Follow-N”規(guī)律，同時這一規(guī)律也可能適用于其它蛋白。這個規(guī)律提示O-糖基化修飾具有潛在的調(diào)控新機(jī)制，特別是N-和O-糖基化修飾之間可能存在的協(xié)同作用，未來有望在極大程度上推動糖生物學(xué)領(lǐng)域的研究。

黃超蘭

（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部精準(zhǔn)醫(yī)療多組學(xué)研究中心主任）

問：根據(jù)您的經(jīng)驗，O-糖基化修飾鑒定的難點(diǎn)在哪里？

答：對于所有的蛋白翻譯后修飾鑒定都普遍存在著幾個相同的難點(diǎn)：（1）修飾豐度相對較低，難以直接鑒定，往往需要進(jìn)行修飾富集，因此對樣本量等要求較高；（2）修飾調(diào)節(jié)為動態(tài)變化過程，鑒定重復(fù)性會相對低一點(diǎn)。而對于O-糖基化修飾，因其特殊性，又有幾個其他因素影響：（1）糖基化修飾的糖鏈形成無固定模版，且受多種糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)雜調(diào)控；（2）規(guī)模化糖鏈結(jié)構(gòu)解析通量低，定性與定量困難；（3）功能性糖基化位點(diǎn)及關(guān)鍵糖結(jié)構(gòu)指認(rèn)困難。

問：Orbitrap Eclipse Tribrid三合一質(zhì)譜聯(lián)用儀在該研究中發(fā)揮了怎樣的作用？

答：在我們的實驗體系中，使用了多種蛋白酶對S蛋白進(jìn)行處理，因此會產(chǎn)生長短不一，形式各異的肽段，而這就要求配套的質(zhì)譜儀器能夠具有多種碎裂模式，而 Orbitrap Eclipse質(zhì)譜儀就很好地滿足了我們的需求。并且Orbitrap Eclipse具有很好的分辨率以及穩(wěn)定性，這對我們的實驗提供了很大幫助。

問：新guan病毒顆粒上提取的S蛋白O-糖基化修飾圖譜的揭示對新xing冠狀病毒肺炎的研究有哪些幫助？

答：我們在實驗中發(fā)現(xiàn)了“O-Follow-N”變化規(guī)律，這對研究糖基化的變化具有很好的提示作用。并且這個規(guī)律也顯示O-糖基化修飾具有潛在的調(diào)控新機(jī)制，特別是N-和O-糖基化修飾之間可能存在的協(xié)同作用，未來有望在極大程度上推動糖生物學(xué)領(lǐng)域的研究。

專家介紹

黃超蘭教授長期致力于質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)前沿新技術(shù)和方法的研究開發(fā)，應(yīng)用范圍包括生物學(xué)基礎(chǔ)、醫(yī)學(xué)和臨床研究，是高度跨界，善于交叉學(xué)科整合，戰(zhàn)略規(guī)劃制定和人員管理的quan方位技能科學(xué)家。