達為科生物E15天胎鼠脊髓神經元的原代培養

一、背景

      神經元原代培養是將胚胎哺乳動物中樞神經系統的部分組織，如大腦皮層、海馬、脊髓等腦組織直接取出，再接種培養的方法。目前國內、外有關神經元培養的方法較多，但在原代培養中神經元的純度和產量方面還存在一些亟待解決的問題。由于神經元是一種高度分化的細胞，相對于其它細胞而言，神經元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養神經元要求的培養方法和營養條件均較為特殊。

     神經細胞的體外培養技術是研究神經源性疾病的發病機制、進程的一個重要工具，能很好的、直觀的反映離體神經元的發育狀況和生理活性，如何建立一個穩定成熟的神經細胞培養體系是神經系統疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫學及臨床醫學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

二、實驗步驟

(1)75%酒精消毒孕鼠，在無菌條件下取出胎鼠，分離并切取脊髓，置于冷的無鈣、鎂的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)；

(2)解剖顯微鏡無菌條件下仔細剝離脊膜及血管；

(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小，0.05%胰酶37℃消化15-20min，每五分鐘振蕩一次；

(4)去掉上清，加入終止液終止消化，吹打10-15次，不能有氣泡，收集上清，剩余組織再消化一次；

(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入種植液1重懸，培養箱內差速貼壁30min；

(6)收集上清，臺盼藍染色計數，按6×10^5cells/孔種入六孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養箱中培養；

(7)培養第二天，全換液更換為種植液2；

(8)培養第四天，半量換液加入5uM的阿糖胞苷，24h全量換液；

(9)之后每周換液兩次。

1d

7d

β-Tubulin Ⅲ

β-Tubulin Ⅲ