激光掃描共聚焦顯微鏡操作步驟及注意事項

激光掃描共聚焦顯微鏡可測定的樣品種類很多．包括生物材料、組織(切片)、細胞(亞細胞)結構等。樣品中熒光的來源主要有如下幾種：自發熒光(autofluorescence)、熒光染色、免疫熒光、熒光蛋白、誘發熒光(induced fluorescence)及酶致熒光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分熒光素的激發和發射波長均可在儀器自帶軟件的染料信息庫中找到。

1．觀察步驟及儀器操作  根據實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察。基本步驟如下：

(1)開啟儀器電源及光源：一般先開啟顯微鏡和激光器，再啟動計算機，然后啟動操作軟件，設置熒光樣品的激發光波長，選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube，PMT)檢測器能得到足夠的信號結果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。

(2)設置相應的掃描方式：在目視模式下．調整所用物鏡放大倍數，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調整雙孔針和激光強度參數，即可得到清晰的共聚焦圖像。

(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結果即可。

(4)關閉儀器：儀器測定樣品結束后，先關閉激光器部分，計算機仍可繼續進行圖像和數據處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統．則應該在激光器關閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。

2．獲取三維圖像  激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT"功能，因此，它可以在不損傷細胞的情況下，獲得一系列光學切片圖像。選用“Z-Stack"模式，即可實現此項功能。其基本步驟是：

①開啟“Z-Stack"選項；

②確定光學切片的位置及層數；

③啟動“Start"，獲得三維圖像。

3．獲取時間序列圖像  共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能，可以自動在實驗者規定的時間內按照設定的時間間隔獲取圖像。只需設定所需的時間間隔以及所需圖像數量，開啟“Start T"功能鍵，即可進行實驗。“Time-Series"功能大大減輕了實驗者的勞動強度，對于熒光漂白恢復和鈣離子成像等實驗非常實用。

4．注意事項及維護保養

(1)儀器周圍要遠離電磁輻射源；

(2)環境無震動，無強烈的空氣擾動；

(3)室內具有遮光系統，保證熒光樣品不會被外源光漂白；

(4)環境清潔；

(5)控制工作溫度在5～25℃。